纳米AsO/PLGA对血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响及其涂层支架的制备

摘要

目的：①研究纳米As2O3/PLGA的制备工艺及其表征和特性；②研究纳米As2O3/PLGA涂层支架的制备工艺及其特性；③研究纳米As2O3/PLGA体外对血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响；④纳米As2O3/PLGA体外诱导血管平滑肌细胞凋亡的分子机制。 材料和方法：①采用w/o/w乳化蒸发法制备纳米As2O3，PLGA，并采用浸涂法制备了纳米As2O3/PLGA涂层支架，用透射电镜（transmission electron microscope，TEM）、扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）、能谱仪（energy dispersive spectrometer，EDS）、图像分析系统（Computer color magic image analysis system CMIAS）分别对其进行表征及特性检测，采用氢化物原子荧光法测定纳米As2O3/PLGA的载药量及包封率，并以生理盐水为释放介质，研究纳米As2O3/PLGA的体外释药率。②采用MTT法研究不同浓度纳米As2O3/PLGA体外分别对兔血管平滑肌细胞（Rabbit vascular smooth muscle cells RVSMCs）和人脐动脉血管平滑肌细胞（Human Umbilical Artery Smooth Muscle Cell HUASMCs）增殖的抑制作用；显微镜下观察纳米As2O3/PLGA处理细胞后的形态学改变，并与传统剂型——亚砷酸（As2O3）进行比较，流式细胞仪测定纳米As2O/PLGA诱导的HUASMCs凋亡率及细胞周期。③Transwell小室法测定不同浓度的纳米As2O3/PLGA对HUASMCs迁移的抑制作用。④RT-PCR方法、Western blot方法检测纳米As2O3/PLGA处理HUASMCs后Bcl-2和Bax基因表达的改变。 结果：①制备的纳米As2O3/PLGA表征：TEM及SEM检测显示纳米As2O3/PLGA为圆形、电子密度高、大小较一致、分散良好的小颗粒；图像分析仪粒径统计学分析其平均粒径约为90nm； EDS证实制备的纳米As2O3/PLGA含有As元素。②制备的纳米As2O3/PLGA涂层支架表征：SEM检测显示支架表面包被了一层纳米颗粒，该纳米颗粒具有与纳米As2O3/PLGA的形态较一致的特征，且EDS证实了As、C和O元素的存在，说明纳米As2O3/PLGA已被包被于支架表面。③氢化物原子荧光法：测定了纳米As2O3/PLGA平均载药量为1．72％，平均包封率为53．75％；考察了纳米As2O3/PLGA的体外动态释放，经计算该药物的累积释放率4d时达到72．37％，15d时达到96．82％，并逐渐进入平台期。④MTT法体外分别测定As2O3和纳米As2O3/PLGA对原代培养的RVSMCs和HUASMCs增殖的抑制作用具有时间依赖性和剂量依赖性。As2O3对RVSMCs和HUASMCs的时间依赖性杀伤效应主要在1～4d和1～3d，但4d（3d）后，As2O3的时间依赖性杀伤效应进入一个平台期，而纳米As2O3/PLGA的时间依赖性杀伤效应则一直呈持续增加趋势。流式细胞仪结果显示药物作用48h及72h后，较高浓度纳米As2O3/PLGA的诱导凋亡作用（18．71％、29．9％）明显强于较低浓度纳米As2O3/PLGA（10．20％、18．29％）。⑤Transwell细胞迁移实验结果显示较高浓度纳米As2O3/PLGA对HUASMCs迁移的抑制作用（77．5％）明显强于较低浓度纳米As2O3/PLGA（32．5％）。⑥RT-PCR及Western blot显示纳米As2O3/PLGA对HUASMCs的Bcl-2基因的表达有抑制作用，对Bax基因的表达有促进作用（Bcl-2/Bax比值降低）。且随着药物浓度的增加Bcl-2/Bax比值降低更明显。 结论：①采用w/o/w乳化蒸发法成功制备了纳米As2O3/PLGA，并采用浸涂法制备了纳米As2O3/PLGA涂层支架。②纳米As2O3/PLGA是一种较理想的缓慢释放制剂，可延长As2O3对血管平滑肌细胞增殖抑制的有效作用时间，并且纳米As2O3/PLGA并不会降低As2O3成分的生物学活性。⑨纳米As2O3/PLGA可以抑制HUASMCs的迁移。④RT-PCR及Western blot实验显示纳米As2O3/PLGA有较强的诱导HUASMCs凋亡作用可能与其改变Bcl-2和Bax基因表达（Bcl-2/Bax比值降低）有关。本研究可能为临床防治支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）提供新的方法。

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论文说明：缩略词表

声明

前言

文献综述 血管内药物涂层支架的制备及应用的研究进展

第一章 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

1.1.2 主要试剂及试剂配制

1.1.3 主要仪器

1.1.4 实验动物及人员

1.2 实验方法

1.2.1 纳米As2O3/PLGA的制备

1.2.2 纳米As2O3/PLGA涂层支架的制备

1.2.3 纳米As2O3/PLGA及其涂层支架的特性检测

1.2.4 纳米As2O3/PLGA对RVSMCs生长的影响

1.2.5 纳米As2O3/PLGA对HUASMCs增殖和迁移的影响

1.2.6 纳米As2O3/PLGA诱导HUASMCs凋亡的分子机制研究

1.2.7 统计学分析

第二章 实验结果

2.1 纳米As2O3/PLGA及其涂层支架的制备及表征

2.1.1 纳米As2O3/PLGA及其涂层支架的一般特性

2.1.2 电镜观察

2.1.3 EDS检测

2.1.4 纳米As2O3/PLGA的含砷量

2.1.5 纳米As2O3/PLGA体外释药速率的动态测定结果

2.2 纳米As2O3/PLGA体外对RVSMCs生长的影响

2.2.1 原代RVSMCs的培养与鉴定

2.2.2 形态学观察

2.2.3 MTT结果

2.3 纳米As2O3/PLGA体外对HUASMCs生长的影响

2.3.1 形态学观察

2.3.2 MTT结果

2.3.3 流式细胞仪检测结果

2.3.4 Transwell细胞迁移实验结果

2.4 纳米As2O3/PLGA处理HUASMCs后相关基因表达结果

2.4.1 RT-PCR结果

2.4.2 Western-blot结果

第三章 讨论

3.1 纳米As2O3/PLGA的制备及表征

3.2 纳米As2O3/PLGA涂层支架的制备及表征

3.3 纳米As2O3/PLGA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

3.4 纳米As2O3/PLGA抑制血管平滑肌细胞增殖的分子机制探讨

3.5 结束语

结论

附图与照片

致谢

参考文献

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