合成磁性纳米粒子标记MMP-9单抗分子探针并检测ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化7.0T MR成像的研究

摘要

目的:通过化学合成的方法制作超顺磁性氧化铁纳米粒子(Ultrasmallsuperparamagnetic iron oxide,USPIO)标记金属基质蛋白酶-9(Matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)单克隆抗体,并探讨其作为 MRI(Magnetic resonaceimaging,MRI)特异性分子探针示踪动脉粥样硬化模型的可行性。
　　 方法:20只7周龄雄性ApoE-／-(Apolipoprotein E-deficient,ApoE-／-)小鼠,高脂饮食(Western diet)喂养1周后,于左侧颈总动脉近分叉处结扎损伤,术后继续高脂饮食喂养,并于术前、术后1周及8周行颈部高场强7.0T MR(Magneticresonance)检查及病理学检查,结合影像学及病理学观察损伤血管的变化,分析动脉粥样硬化形成过程及影像学表现。
　　 采用EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hyarochloride)化学连接剂将MMP-9单克隆抗体与DMSA[meso-2,3-dimercaptosuccinicacid,(HOOCCH(SH)-CH(SH)-COOH)]修饰的USPIO相结合,形成具有免疫学活性的MR分子探针(Ab—MMP-9-USPIO)。将0.05mg的USPIO溶液中分别加入12.5、25、50、100、200μg的单克隆抗体Anti-MMP-9(Antibody of MMP-9,Anti-MMP-9),通过ELISA(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)及Western blotting方法检测生成物的生物学活性。将上述生成物放置3天、100天后再次行ELISA实验,检测合成的分子探针的稳定性。
　　 将合成好的MR磁性粒子探针经小鼠尾静脉注射,注射剂量为45mgFe／kg计算,分别于0、4、6、24、48小时对小鼠颈部行7.0T MR扫描检查,扫描结束后作相应的的病理学(普鲁士蓝染色和免疫组织化学)检查。
　　 结果:7周龄雄性ApoE-／-小鼠高脂饮食喂养1周后,行左侧颈总动脉结扎术。术前颈动脉MRI显示两侧颈动脉无影像差异,管壁光滑,肉眼见动脉管壁红润,光滑；病理切片示内膜光滑、连续。术后1周MRI显示损伤侧血管壁信号稍高,病理切片上显示损伤侧血管内膜下有少量炎性细胞聚集。术后8周MRI T2WI示左侧颈动脉动脉管壁增厚,以内膜增生明显,血管管腔狭窄,管壁信号稍呈不均匀等高信号,肉眼见损伤侧血管呈黄白色条状,管壁增粗、僵硬,相应病理结果示左侧颈动脉动脉粥样硬化斑块形成,内膜明显增生,内膜下有大量的脂质及炎性细胞聚集,外膜局部增生。
　　 ELISA实验所得的生成MMP-9单克隆抗体超微超顺磁性纳米颗粒(Ab—USPIO)有生物学活性,吸光度值随抗体含量增加而增大,与阴性对照USPIO组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。分别间隔3天、100天后再次经ELISA测量,100μg及200μg单抗组内吸光度值降低,差异有统计学意义(P＜0.05),而12.5、25、50μg各组内差异无统计学意义(P＞0.05)。Western blotting试验显示,结合单抗的USPIO于PVDF膜上92kDa处显示出条带,而单纯UPSIO对照组则未显示条带。
　　 经小鼠尾静脉注射磁性粒子探针后于0、4、6、24、48小时不同时间点行小鼠颈部MR扫描,测得注射探针后6小时MRI图像上左侧颈动脉管壁信号改变最为明显,此时损伤管壁信号于T2WI像上降低最显著,管腔呈“假性扩大样”改变,相应病理学检查显示损伤侧动脉血管壁内膜有普鲁士蓝染色阳性颗粒,说明内膜下有铁粒子沉积,免疫组织化学切片示巨噬细胞周围见较多棕色颗粒,说明内膜下有MMP-9分泌。
　　 结论:EDC化学方法可制备出单克隆抗体超微超顺磁性氧化铁纳米颗粒,同时仍具有抗体的免疫学活性及生物稳定性,同时该分子探针可以作为MRI分子探针在体显像小鼠颈动脉粥样硬化斑块,为动脉粥样硬化斑块的分子成像提供了实验依据。