AcrAB-TolC外排泵系统对肺炎克雷伯菌耐药性和黏附侵袭能力的影响

摘要

肺炎克雷伯菌是重要的条件致病菌和医源性感染菌，可引起呼吸系统、泌尿系统、血液系统等多部位感染。近年来，随着抗菌药物的不规范使用，肺炎克雷伯菌对多种抗生素尤其是喹诺酮类药物产生了耐药性，严重影响临床疗效。而药物外排作用是革兰氏阴性菌的产生耐药性的主要途径之一。因此，对外排泵的研究不仅有助于阐明细菌耐药本质，同时对研制新型抗菌药物也具有重要指导意义。
　　AcrAB-TolC外排泵系统广泛分布于革兰氏阴性菌中，属于RND超家族，以质子驱动力为能量，通过外排泵将进入菌体内的药物或对自身有害的物质排出体外。同时有文献报道，肺炎克雷伯菌AcrAB-TolC外排泵可能和该菌毒力有关。该外排泵主要由膜融合蛋白(AcrA)、外排转运蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)三部分组成，整体调控因子MarA和RamA增加该泵的外排作用，局部调控因子AcrR以阻遏AcrAB的外排作用。本课题希望进一步探讨KP菌AcrAB-TolC外排泵系统针对不同的外排底物，其结构基因和调控基因不同的表达水平，以及该泵对细菌黏附侵袭和杀伤细胞的能力的影响。
　　本研究收集了2株肺炎克雷伯菌标准株和41株临床分离株，用有机溶剂耐受实验(Organic Solvent Tolerant，OST)和抗生素MIC逆转实验，比较不同抗生素的肺炎克雷伯菌耐药株和敏感株之间外排作用的差异。通过PCR来检测AcrAB-TolC外排泵系统结构基因acrA、acrB、tolC和正调控基因marA、ramA、负调控基因acrR在肺炎克雷伯菌菌株中的分布。利用半定量RT-PCR检测不同抗生素耐药株和敏感株的AcrAB-TolC系统各结构基因和调控基因的转录水平，并据此分析耐药性、有机溶剂耐受、抗生素MIC和逆转实验的关系。另外，分别将ramA重组质粒、载体质粒转入肺炎克雷伯菌标准株ATCC43816，得到AC-1株和AC-2株。通过RT-PCR检测AC-1株、AC-2株和标准株结构基因的转录，以及检测它们的耐药性、有机溶剂耐受、MIC和逆转实验的关系，来探讨ramA对其结构基因的表达和细菌耐药表型的影响。
　　结果显示：AcrAB-TolC外排泵系统结构基因acrA、acrB、tolC和调控基因marA、ramA、acrR广泛分布在肺炎克雷伯菌株中。喹诺酮类耐药株和敏感株acrA、tolC和ramA转录水平存在统计学差异(P<0.05)，而acrB、marA和acrR的转录水平差异不明显。四环素耐药株与敏感株的tolC转录水平存在显著的差异(P<0.01)，其它基因的转录水平差异均不明显。而氯霉素耐药株与敏感株的tolC和marA转录水平存在差异(P<0.05)，其它基因的转录水平差异均不明显。有机溶剂耐受试验阳性株和阴性株中，tolC转录水平存在差异(P<0.001)。在喹诺酮类、四环素、氯霉素MIC逆转试验阳性株中，大多数阳性株acrA、tolC和ramA、marA高表达，而acrB和acrR低表达。
　　和AC-2株和敏感株相比，RT-PCR结果显示：AC-1株的结构基因转录水平增高，并且其喹诺酮类、四环素MIC明显升高，有机溶剂耐受试验转阳性。因此，结构基因tolC在膜渗透性药物(四环素和氯霉素)和有机溶剂的外排中起主要作用，而acrA和tolC在外排喹诺酮类药物中起主要作用，调控基因ramA和marA分别在肺炎克雷伯菌株外排喹诺酮类药物和氯霉素中发挥重要作用。另外，和AC-2株和标准株相比，RT-PCR结果显示：AC-1株的结构基因转录水平增高，并且其喹诺酮类、四环素MIC明显升高，有机溶剂耐受试验转阳性，ramA对其结构基因的表达和细菌外排药物和有机溶剂发挥重要作用。
　　另外，本研究利用细菌黏附侵袭实验和流式细胞仪检测方法，并结合RT-PCR实验分别检测该菌外排泵系统结构基因表达水平，探讨AcrAB-TolC外排泵系统是否会影响肺炎克雷伯菌黏附侵袭和杀伤细胞能力。结果发现上调ramA转录水平可以增强AcrAB-TolC外排泵系统三个结构基因的转录水平，降低KP菌的黏附侵袭能力，增加KP菌杀伤人肺癌A549细胞的能力。