志贺菌外排泵AcrAB-TolC及其调控基因突变与氟喹诺酮耐药性关系的研究

摘要

志贺菌属细菌是导致细菌性痢疾的主要病原菌,志贺菌多重耐药株逐年增多。随着抗菌药物的广泛使用，志贺菌耐药问题越来越严重。氟喹诺酮类药物，因其独特的作用机制，抗菌谱广，良好的抗菌活性和优秀的药物动力学等特征，成为临床治疗细菌性痢疾的一线药物。但随之出现的耐氟喹诺酮菌株也逐年增加。细菌对氟喹诺酮产生耐药的机制主要包括：染色体介导的靶位酶基因突变、质粒介导的外排泵基因qepA、质粒携带的氨基糖苷乙酰转移酶的变异基因aac（6’）-Ib-cr、细胞膜孔蛋白缺失或表达下降、膜主动外排泵基因激活(主要是acrAB-tolC系统)或过度表达等。研究表明,主动外排系统是细菌产生多重耐药的主要原因，尤其是耐药结节细胞分化家族（resistance-nodulation-division RND）成员对细菌获得性耐药起重要作用，目前国内外研究较多的耐多药外排泵是大肠埃希菌AcrAB-TolC。现有研究表明，该泵在志贺菌属细菌中也存在，调控基因marOR突变可能对耐药性产生影响。
　　研究目的：了解和掌握天津市三家医院临床分离志贺菌的血清型分布及主要流行型别；志贺菌临床株对临床常用抗菌药物的耐药情况；对氟喹诺酮耐药株从染色体靶位酶基因、外排泵AcrAB-TolC泵基因acrA、acrB及其调控基因marOR、acrR、soxS及质粒介导的外排泵基因qepA基因进行扩增并测序，探讨上述基因突变与氟喹诺酮类耐药之间的关系。
　　材料与方法：本研究收集2009年-2013年天津医科大学总医院、天津医科大学第二医院、天津市儿童医院肠道门诊分离的志贺菌临床株。1，采用血清凝集法确定血清型,明确本地区近年流行的主要血清型。2，采用K-B纸片扩散法测定志贺菌临床株对17种临床常用抗生素的敏感性。应用萘啶酸、环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星和诺氟沙星5种抗菌药物筛选出氟喹诺酮耐药临床株。3，通过PCR扩增技术对志贺菌临床株的gyrA、parC基因、外排泵AcrAB-TolC泵基因acrA和acrB、外排泵调控基因marOR、acrR、soxS及质粒外排泵基因qepA基因进行扩增、测序,测序结果在Genebank上进行比对。
　　实验结果：1、经常规生化及血清凝集实验证实，159株受试菌株中福氏志贺菌57株，宋内志贺菌102株。福氏志贺菌包括F1a，1b，F2a，F2b，F3a，F3b，F4a，F4b，F5a，F5b，F6，Fx，Fy亚型。2、药敏结果显示:临床分离志贺菌对萘啶酸耐药率最高,为98.49％,其次为链霉素94.33%、氯霉素93.71%。对头孢曲松、头孢噻肟和头孢哌酮的耐药率分别为1.25%、1.25%和0.62%。未发现对亚胺培南耐药。对氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星耐药率分别为4.71%、5.03%、3.14%，对左氧氟沙星耐药率为1.88%。159株志贺氏菌中多重耐药株156株，占全部受试菌株的98.11%。喹诺酮类耐药株11株，其中耐三种及三种以上氟喹诺酮类抗菌药的有7株，占63.63%；11株氟喹诺酮耐药菌对萘啶酸的耐药率100.00%，对环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为72.72%、45.45%、63.63%和27.27%。3、11株氟喹诺酮耐药株和8株氟喹诺酮敏感株均扩增出gyrA、parC基因；4株耐药菌可见gyrA83（Ser→Leu）及parC80(Ser→IIe)位突变；1株耐药菌仅有parC80(Ser→IIe)位突变,2株耐药菌gyrA205苯丙氨酸缺失；其余4株耐药菌gyrA和parC均未突变；8株敏感株均未发现gyrA和parC突变。10株耐药菌和4株敏感菌acrA、acrB、marOR、soxS和acrR基因扩增呈阳性。acrA、 acrB、acrR、soxS基因有散在点突变存在。10株氟喹诺酮耐药菌marOR基因都存在第36、37、38、39位CATT碱基缺失，而氟喹诺酮敏感菌株中marOR未见上述位点CATT缺失。所有氟喹诺酮耐药菌及敏感菌株均未扩增出qepA基因。
　　结论：2009年-2013年天津市三家医院临床分离志贺菌血清型主要为宋内志贺菌,其次为福氏志贺菌。志贺菌对临床多种常用抗生素耐药率较高,多重耐药菌株比例高达98.11%。外排泵调控基因marOR第36、37、38、39位CATT碱基缺失可能与志贺菌对氟喹诺酮耐药有关。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、志贺菌临床株血清鉴定、分布及耐药性分析

1.1材料和方法

1.1.1实验材料

1.1.2实验方法

1.2结果

1.2.1血清鉴定结果

1.2.2 药敏结果

1.3讨论

1.3.1志贺菌血清型分布

1.3.2 志贺菌耐药性

1.3.3 志贺菌多重耐药性

1.3.4 不同血清型志贺菌耐药性不同

1.4小结

二、志贺菌外排泵AcrAB-TolC及其调控基因突变与氟喹诺酮耐药性的关系

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2 实验方法

2.2结果

2.2.1 基因扩增结果

2.2.3 gyrA、parC基因测序

2.2.4 acrA基因测序

2.2.5 acrB基因测序

2.2.6 acrR基因测序

2.2.7 marOR基因测序

2.2.8 soxS基因测序

2.3讨论

2.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 志贺菌对氟喹诺酮类耐药机制的研究进展

致谢