妊娠相关血浆蛋白A的纯化和单克隆抗体的制备

摘要

背景：妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy-associated Plasma Protein A，PAPP-A)是一种与妊娠相关的大分子糖蛋白，主要是由胎盘合体滋养层和蜕膜产生。母体血清PAPP-A含量与妊娠周期密切相关，随孕周的增加而持续上升，到妊娠末期达到高峰。PAPP-A是早孕阶段母血中一个敏感特异的血清标志物，孕早期母血中低水平的PAPP—A与后来发生的各种染色体异常、胎儿畸形、产科并发症等异常妊娠有关。目前，在早孕阶段测定孕妇血清中PAPP-A已经应用于临床异常妊娠的预测，特别对于唐氏综合征等染色体异常的筛查有较大的临床价值。由于母血中低水平的PAPP-A与胎盘功能异常有关，因此PAPP-A是早孕阶段预测异常妊娠的一个有价值的指标。新近的研究表明PAPP-A是急性冠脉综合征早期识别、进行危险分层以及评价预后的一个新标志物。 目的：从健康孕妇血清中分离纯化PAPP-A蛋白，用所纯化的抗原免疫小鼠，筛选分泌PAPP-A单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备抗人PAPP-A单克隆抗体，为建立PAPP-A检测方法及其临床应用提供基石出。 方法：利用。DEAE-Sepharose CL-6B离子交换和Heparin-SepharoseCL-6B亲和层析从晚孕血清中分离纯化PAPP-A，变性SDS-PAGE测定其相对分子质量为200 kDa，western blotting鉴定其特异性。取24μg纯化后的PAPP-A加等体积福氏佐剂免疫Balb/c小鼠，共3次，融合前3天加强免疫1次，用聚乙二醇(PEG)行细胞融合，用杂交瘤细胞选择性培养基次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷(HAT)及次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT)选择性培养，间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选培养上清，包被的抗原为纯化后的PAPP-A，选择对PAPP-A阳性的多克隆孔进行亚克隆，间接ELISA筛选亚克隆板孔的细胞培养上清。扩大培养分泌PAPP-A单克隆抗体的细胞株，以5×105-1×106个细胞/只接种于一周前腹腔注射0.5ml/只液体石蜡油的Ballb/c小鼠。接种后7天开始收集腹水，间接ELISA检测腹水PAPP-A抗体滴度，所得腹水用蛋白A亲和层析柱纯化单抗，对得到单克隆抗体进行分析鉴定。 结果：纯化的PAPP-A蛋白行SDS-PAGE电泳显示主条带为PAPP-A亚基的位置，其分子量大小约200 kDa，proMBP亚基的分子量大小约50-90 kDa。PAPP-A亚基可与PAPP-A单克隆抗体发生特异性反应。筛选出12株稳定分泌PAPP-A McAbs的杂交瘤细胞株，8株是IgGl亚型，4株是IgG2a亚型。单抗SDS-PAGE分析显示轻链分子量约为28.7 kDa，重链约为51.3 kDa。Western blotting和免疫组织化学分析证实所获得的McAb对PAPP-A有较高的特异性及敏感性。 结论：从孕妇血清中成功分离得到妊娠血浆相关蛋白A，并获得稳定分泌抗人PAPP-A单克隆抗体的细胞株，制备出抗人PAPP-A的单克隆抗体。可用于PAPP-A免疫检测方法的建立。

目录

论文说明：缩略语

声明

引言

第一部分妊娠相关血浆蛋白A的纯化与鉴定

材料和方法

1材料

2方法

结果

讨论

第二部分PAPP-A单克隆抗体的制备和鉴定

材料和方法

1材料

2方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

综述

研究成果