p-Akt、survivin在乳腺癌中的表达及以此为靶向的乳腺癌放射治疗增敏研究

摘要

乳腺癌作为一种全身性的疾病需要使用不同的干预手段进行综合治疗，包括使用手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、生物治疗、内分泌治疗等。放射治疗在乳腺癌患者的局部控制中发挥着关键性的作用，能降低肿瘤在乳腺、胸壁及腋窝的局部复发。同时，有局部复发高危因素的乳腺癌患者，放射治疗也能提高总的生存率，降低复发率和死亡率。但乳腺癌产生对放射治疗的抵抗耐受时，使得这一治疗手段实施存在困难。对各种治疗措施包括放射治疗抵抗耐受的机制可能是通过在肿瘤细胞中活化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinosit01-3-kinase，P13K/Akt)和/，或上调survivin的表达。 本课题围绕p-Akt和survivin在乳腺癌中的表达及放射治疗后的变化情况，探讨它们在乳腺癌放射治疗抵抗耐受中的作用。并研究通过鱼藤素同时阻断Akt信号通路和抑制survivin的表达从而达到在体外和裸鼠移植瘤模型体内增强乳腺癌对放射治疗的敏感性。为将来临床应用此策略提高乳腺癌对放射治疗的敏感性提供实验依据。 第一部分 p-Akt、survivin在乳腺癌组织中的表达与临床意义 【目的】探讨p-Akt、survivin在乳腺癌组织中的表达及其临床病理学意义，用于指导乳腺癌的临床治疗。 【材料和方法】收集2006年6月-2 006年12月南京医科大学第一附属医院乳腺内分泌外科中心手术切除的68例女性乳腺癌患者标本，术前未接受放、化疗和内分泌治疗，均有组织病理学确诊。10例正常乳腺组织标本作对照。采用SP免疫组织化学方法检测p-Akt、survivin、HER2、ER、PR、p53的表达，并分析p-Akt、survivin与其它各指标的关系。 【结果】正常乳腺组织病理标本10例，乳腺癌组织病理标本68例。其中浸润性导管癌58例，导管内癌8例，小叶癌2例。病理分期(pTNM)：I期16例，Ⅱ期35，Ⅲ-Ⅳ期17例。运用免疫组织化学SP法检测p-Akt、survivin阳性表+达细胞均为细胞胞浆和/或胞核着色。有关生物学指标的阳性表达率为：p-Akt 41.2％(28/68)；survivin 51.5％(35/68)；HER2 33.8％(23/68)；ER 58.8％(40/68)；PR 57.4％(39/68)；p53 55.9％(38/68)。正常乳腺组织中p-Akt、survivin均无表达。进一步分析显示，p-Akt、survivin的表达与HER2的表达呈正相关(r值分别为0.412，0.383；P值分别为0.001，0.001)；与PR的表达呈负相关(r值为-0.306；P值为0.011)。p-Akt阳性表达与患者年龄无关，但与肿瘤病理分期、淋巴结转移状况和肿瘤大小相关。survivin的阳性表达与患者年龄、肿瘤病理分期和肿瘤大小无关，但与淋巴结转移状况相关. 【结论】p-Akt和survivin在乳腺癌组织中的活化和高表达与肿瘤的发展显著相关，是乳腺癌患者预后不良的判断指标之一。p-Akt和survivin可以作为乳腺癌抗肿瘤治疗的新靶标。 第二部分放射治疗对乳腺癌细胞中p-Akt和survivin表达的影响及鱼藤素增强乳腺癌细胞放射治疗敏感性的研究 【目的】探讨p-Akt和survivin在乳腺癌放射治疗抵抗耐受及以此为靶标鱼藤素放射治疗增敏中的作用，为未来的临床研究寻找有用的分子标记物。 【材料和方法】使用Y射线照射或鱼藤素及两者联合处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞。采用MTT比色法进行细胞生长抑制实验；用Westernblot方法检测Akt、phospho-Ser473-Akt、survivin、cleaved caspase-3蛋白的表达情况；流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况；克隆源细胞检测测定细胞存活分数。 【结果】鱼藤素对于MDA-MB-231细胞生长抑制作用具有时效和量效关系。不同剂量的Y射线照射对于MDA-MB-231细胞生长抑制率不同，3Gy的Y射线照射48h抑制率为(38±4)％，4Gy的Y射线照射抑制率为(56±7)％。Y射线照射与鱼藤素联合使用的细胞生长抑制率明显高于Y射线照射单独使用的细胞生长抑制率(P<0.01)。3Gy的Y射线与10nmol/L鱼藤素联合对细胞生长抑制有协同效应。10nmol/L鱼藤素能明显地抑制MDA-MB-231细胞磷酸化Akt和survivin蛋白的表达，增加cleaved caspase-3蛋白水平。3Gy的Y射线能诱导MDA-MB-231细胞磷酸化Akt、cleaved caspase-3蛋白水平上调，对survivin蛋白的表达无影响。而联合使用能进一步抑制MDA-MB-231细胞磷酸化Akt和survivin蛋白的表达水平(P<0.01)， cleaved easpase-3蛋白表达水平增加(P<0.001)。10nmol/L鱼藤素与3Gy的Y射线联合处理MDA-MB-231细胞周期阻滞于G2/M期，细胞凋亡百分率明显增加(P<0.01)。10nmol/L鱼藤素能增强乳腺癌细胞对Y射线处理的敏感性，降低克隆源性细胞的生存。 【结论】鱼藤素能减弱放射线对MDA-MB-231细胞促生存信号通路Akt磷酸化的诱导激活，增强乳腺癌细胞对放射治疗的敏感性。其作用机理主要是通过抑制细胞磷酸化Akt和survivin的表达，增加caspase依赖的细胞凋亡，阻滞细胞周期于G2/M期。 第三部分鱼藤素同时阻断Akt信号通路和抑制survivin的表达对乳腺癌裸鼠移植瘤模型放射治疗增敏的研究 【目的】研究鱼藤素对乳腺癌裸鼠移植瘤模型的治疗作用，以及与放射治疗联合使用的放射增敏效果，为今后临床研究提供实验依据。 【材料和方法】动物：BALB/c雌性裸鼠，4-5周龄，体重18±2g/只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，共30只。接种MDA-MB-231人乳腺癌细胞成瘤后20天左右，肿瘤体积为100-140mm3时24只平均分成4组：对照组(C组)、deguelin组(D组)、放射治疗组(RT组)、deguelin+放射治疗组(D+RT组)。处理的方法及剂量：C组玉米油溶剂80μl/只/次，每日1次灌胃，每周5次；D组deguelin4mg/kg(80μl)每日1次灌胃，每周5次：RT组用20y60Co照射，每日1次，每周5次；D+RT组给予deguelin和2Gy 60Co处理，剂量和方法同上.连续处理6周，每周称量裸鼠体重并用电子游标卡尺测量肿瘤大小。使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)=长(mm)×宽2(mm2)×π/6。处理结束后的第二周处死裸鼠，切取肿瘤，记录裸鼠体重、肿瘤体积和重量，计算抑瘤率；同时切取部分肿瘤组织作流式细胞和westernblot检查。 【结果】各组裸鼠体重和移植生长肿瘤的体积在处理前具有均衡可比性。连续处理6周，肿瘤生长体积曲线显示C组肿瘤生长最快，RT组次之，D组肿瘤生长较慢，而D+RT组肿瘤生长有缩小的趋势。处理结束后肿瘤的平均体积(mm3)为：C组728.8±182.7，RT组427.8±106.4，D组260.8±68.4，D+RT组95.5 ±18.7。平均肿瘤重量(g)为：C组1.28±0.21，RT组0.68±0.14，D组0.42±0.06，D+RT组0.25±0.05。平均抑瘤率为：RT组46.88％±10.95％，D组67.19％±5.01％，D+RT组80.60％±3.68％。各处理组之间及处理组与对照组之间比较差异均有统计学意义(P<0.000)。 流式细胞仪检测表明与对照组相比，RT组对细胞周期的影响和D组相似，都可使Gl期和GJM期细胞比例增加，S期细胞比例减少，细胞凋亡率增加。但RT组作用无D组强。D+RT组的影响最大。各处理组与对照组之间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。 Western blot 检测果表明，RT组的p-Akt、survivin的表达水平均增加，与其它组比较差异有统计学意义(P<0.01)。p-Akt和survivin的表达水平在D组衣D+RT组均是降低的，D+RT组下降更为明显(P<0.004)。cleaved caspase-3的表达在各组均是增加的，以D+RT组增加最为明显(P<0.001)。 【结论】放射治疗能上调乳腺癌组织p-Akt和survivin的表达水平，鱼藤素能抑制其上调。鱼藤素和放射治疗均能增加cleaved caspase-3的表达，诱导肿瘤组织凋亡。两者联合应用后抑制肿瘤生长作用明显高于鱼藤素或放射治疗的作用，鱼藤素能增强裸鼠乳腺癌移植瘤对放射治疗的敏感性。同时联合应用并没有增加荷瘤小鼠的不良反应，以p-Akt和survivin为靶向的鱼藤素对乳腺癌放射增敏治疗是一种新的策略。

目录

论文说明:缩略词中英文对照

声明

前言

第一部分p-Akt、survivin在乳腺癌组织中的表达与临床意义

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分放射治疗对乳腺癌细胞中p-Akt和survivin表达的影响及鱼藤素增强乳腺癌细胞放射治疗敏感性的研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分鱼藤素同时阻断Akt信号通路和抑制survivin的表达对乳腺癌裸鼠移植瘤模型放射治疗增敏的研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

总结

综述一 PI3K/Akt在肿瘤放射增敏治疗中的研究进展

综述二 以survivin为靶标的肿瘤放射治疗增敏研究进展

致谢

附录