EBV特异性CTL的制备及其对EBV阳性肿瘤细胞杀伤效应的研究

摘要

EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)属于人类疱疹病毒γ家族，广泛存在人群中，成人感染率达到90％以上，是第一个公认的致肿瘤病毒。鼻咽癌和淋巴瘤是常见的恶性肿瘤，是EBV潜伏感染、环境和宿主基因遗传等多种因素共同参与、相互作用而逐步形成的复杂性疾病，预后较差。几乎所有的鼻咽癌细胞以及大多数的淋巴瘤细胞能够检测到EBV基因组的存在，并通过编码表达潜伏膜蛋白(Latent membrane protein，LMP)1、LMP2参与疾病的发生、发展以及转移，这使得这些病毒蛋白成为理想的肿瘤靶抗原，为进行过继性细胞免疫治疗提供了有利的条件。肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)是由抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)摄取加工肿瘤特异性抗原肽，协同白介素(Interleukin)-2等细胞因子的作用，体外激活初始T淋巴细胞生成的。因LMP1、LMP2免疫原性较低，如何选择合适的APC稳定的制备数量充足、活性良好的CTL是对上述两种EBV阳性肿瘤进行过继性免疫治疗的关键。 目的： 本研究拟选择树突状细胞(Dendritic cells，DC)以及EBV转化B淋巴细胞生成的永生化淋巴母细胞系(Lymphoblastoid cell lines，LCLs)作为两种APC，体外制备稳定增殖的EBV特异性CTL，并通过多种方法检测EBV-CTL对EBV阳性肿瘤细胞的杀伤作用，为选择合适的APC进行下一步的临床研究提供理论基础。 方法： 1.T淋巴细胞的培养:分离人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclearcell，PBMC)，经CD3、CD28单克隆抗体刺激后，在IL-2的作用下大量扩增外周血T淋巴细胞。CCK-8检测不同培养条件对细胞增殖的影响，选择合适的培养基用于细胞的培养。 2.DC细胞的制备:PBMC贴壁分离，在IL-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)等细胞因子作用下诱导生成DC细胞并通过负载LMPs混合多肽刺激DC成熟，流式细胞仪检测细胞表面分子的表达。 3.LCLs的构建:制备EBV病毒上清，按比例混合完全培养基培养PBMC，诱导生成LCLs。通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达，RT-PCR扩增细胞基因组，了解细胞的生物学特征。 4.丝裂霉素灭活LCLs:CCK-8检测不同浓度丝裂霉素灭活后LCLs增殖速度，绘制增殖曲线，选择灭活程度彻底、损伤小的浓度作为合适的灭活条件。 5.EBV-CTL的生物学活性研究:负载抗原的DC及灭活后LCLs作为APC体外诱导T淋巴细胞生成EBV-CTL，通过CCK-8、流式细胞仪、ELISA等方法对EBV-CTL体外杀伤肿瘤细胞、分泌IFN-γ的能力进行分析判断。 结果： 1.对四种培养条件下T淋巴细胞增殖情况进行分析:1640+10％FBS与GT-T551+2％自身血浆两种培养条件下细胞增殖在第9天达到80倍。 2.制备的DC形态不规则，边缘有明显的毛刺状突起。流式细胞仪检测细胞表面分子CD83、CD86的表达有明显提高，表达量分别为42.07％及45.09％。 3.成功构建LCLs，流式细胞仪检测细胞表面高度表达CD40、CD19、CD80、 CD86分子，表达量分别为97.23％、90.06％、85.97％、50.41％;RT-PCR成功扩增LMP1、LMP2基因片段。 4.100μg/ml、150μg/ml丝裂霉素灭活LCLs后对细胞进行培养，细胞增殖明显被抑制，24h后反应达到稳定状态，细胞停止增殖。 5.DC-EBV-CTL体外杀伤鼻咽癌细胞和淋巴瘤细胞24h，杀伤率分别为77.15％±3.18％、58.72％±6.30％，同时IFN-γ的分泌量为491.24±23.80pg/ml;LCLs-EBV-CTL对鼻咽癌细胞和淋巴瘤细胞的杀伤率分别72.72％±8.45％、75.6％;杀伤过程中LCLs-EBV-CTL中分泌IFN-γ的细胞比例为25.04％，增加了12.3倍。 结论： 1.1640+10％FBS与GT-T551+2％自体血浆两种培养基可以很好地促进细胞的增殖，选择1640+10％FBS作为下一步基础实验中T淋巴细胞的完全培养基。 2.制备的DC具有典型的形态学特征，细胞表面高度表达CD83、CD86分子，提示为成熟DC细胞，具备抗原提呈能力。 3.LCLs构建成功，高度表达细胞表面分子CD40、CD19、CD80、CD86，提示细胞来源于B淋巴细胞，具备抗原提呈能力;RT-PCR成功扩增LMP1、LMP2基因片段，证明细胞转化成功，可作为APC提呈EBV特异性抗原。 4.诱导生成的DC-EBV-CTL、LCLs-EBV-CTL对EBV阳性的鼻咽癌细胞及淋巴瘤细胞具有高度特异性杀伤作用，两种EBV-CTL在抗原再次刺激后均可以分泌大量的IFN-γ，间接影响免疫反应。

目录

声明

摘要

前言

研究一 DC细胞的制备及生物学功能研究

材料与方法

结果

讨论

研究二 LCLs细胞系的构建及生物学特性鉴定

材料与方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述 EB病毒及相关肿瘤免疫治疗的研究进展

附录1 缩略语

附录2 在读期间参与的工作

致谢