EB病毒特异性TCR基因相关的重组质粒及构建抗EBV特异性CTL的方法

摘要

本发明公开了一种EB病毒特异性TCR基因相关的重组质粒及其转导正常T细胞获得抗EBV特异性CTL的方法。该重组质粒是由TCR Vα15基因、pIRES载体和TCR Vβ1基因组成，本发明EB病毒特异性细胞毒T细胞克隆相关的TCR Vα15－pIRES－TCR Vβ1重组质粒转导至外周血T细胞，可获得特异性识别EB病毒相关抗原的大量高效细胞毒T细胞，能够特异性地杀伤EBV

说明书

技术领域

本发明属于血液肿瘤中抗病毒和抗肿瘤免疫技术领域，特别涉及一种EBV(EB病毒，Epstein Barr virus)特异性TCR(T细胞受体，T cell receptor)基因相关的TCRVα15-pIRES-TCRVβ1重组质粒，及其转导正常T细胞获得抗EBV特异性CTL(cytotoxic T cells，细胞毒T细胞)的方法。

背景技术

EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)与淋巴组织的恶性肿瘤密切相关。诱导产生抗EBV⁺肿瘤细胞的EB病毒特异性细胞毒T细胞(cytotoxic T cells，CTL)，发挥其抗肿瘤或抗病毒特性，能有效地清除EBV⁺肿瘤细胞，对于EB病毒相关肿瘤的治疗有着良好的应用前景。但是，单纯扩增供者的特异性细胞毒T细胞，往往来源受限或者量效不足；国外有利用导入自杀基因或基因修饰树突状细胞作为瘤苗来进行HSCT后肿瘤免疫治疗，取得了一定成效，但操作较为耗时繁琐，难以推广。

从正常人T细胞中诱导出特异性细胞毒T细胞治疗相应的疾病在国外已经有所开展，抗原特异细胞毒T细胞如EBV-CTL的应用已进行了小规模的I期临床研究；而体外TCR基因转导病人T细胞产生抗肿瘤细胞毒T细胞的可行性已在黑色素瘤治疗中得以证实，国外也有研究证实识别EB病毒抗原LMP的TCR基因转染后，可形成特异性抗EBV⁺细胞的细胞毒T细胞，但由于逆转录病毒载体的使用而限制了应用性。

诱导产生抗EBV⁺肿瘤细胞的EB病毒特异性细胞毒T细胞，能有效地清除EBV⁺肿瘤细胞，对于EB病毒相关肿瘤的治疗有着良好的应用前景。但是，既往依靠单纯扩增供者的特异性细胞毒T细胞，往往来源受限或者量效不足；国外有利用导入自杀基因或基因修饰树突状细胞作为瘤苗来进行HSCT后肿瘤免疫治疗，取得了一定成效，但操作较为耗时繁琐，难以推广。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的首要目的在于提供一种EB病毒特异性TCR基因相关的TCRVα15-pIRES-TCRVβ1重组质粒。

本发明的另一目的在于提供利用上述TCRVα15-pIRES-TCRVβ1重组质粒构建抗EB病毒特异性细胞毒T细胞的方法。

本发明利用EB病毒抗原肽获得病毒特异性细胞毒T细胞克隆，进行T细胞克隆性分析后，将EB病毒特异性细胞毒T细胞克隆中优势表达的TCRVα15和Vβ1基因转入真核表达载体，构建TCRVα15-pIRES-TCRVβ1重组质粒，再通过转基因技术将特异性TCRVα15-pIRES-TCRVβ1质粒转导到T细胞，从而得到大量EB病毒特异性细胞毒T细胞。

本发明是用识别EB病毒相关抗原BMLF(裂解蛋白BMLF，BamHfragment M leftward reading frame)的TCRVα15和TCRVβ1双基因同时转导来获得特异性识别EB病毒抗原的高效细胞毒T细胞，采用更为安全和高效的转染方式，具有较高的可行性。通过转基因技术将EB病毒特异性细胞毒T细胞克隆相关的TCRVα15-pIRES-TCRVβ1质粒转导至外周血T细胞中，常规培养扩增后可获得特异性识别EB病毒相关抗原的高效细胞毒T细胞，这种特异性细胞毒T细胞具有更多的可操作性和通用性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种EB病毒特异性TCR基因相关的TCRVα15-pIRES-TCRVβ1重组质粒，其特征在于：所述TCRVα15-pIRES-TCRVβ1重组质粒是由TCRVα15基因、pIRES载体和TCRVβ1基因组成，所述TCRVα15基因序列如下：

ATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTCCTGTTTTTGTGGCTGCAGCTGGACTGTATGAGTAGAGGAGAGGATGTGGAGCAGAGTCTTTTCCTGAGTGTCCGAGAGGGAGACAGCTCCGTTATAAACTGCACTTACACAGACAGCTCCTCCACCTACTTATACTGGTATAAGCAAGAACCTGGAGCAGGTCTCCAGTTGCTGACGTATATTTTTTCAAATATGGACATGAAACAAGACCAAAGACTCACTGTTCTATTGAATAAAAAGGATAAACATCTGTCTCTGCGCATTGCAGACACCCAGACTGGGGACTCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGAacctATACAGCACCCTCACCTTTGGGAAGGGGACTATGCTTCTAGTCTCTCCAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCTGTGCAAACGCCTTCACACAGCATTATTCCAAA GACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGTTGTGGTCCAGC；

所述TCRVα15基因序列共810bp。其中：

V区为：ATGAAGACATTT..........................TGTGCAGAGA；

J区为：ATACAGCACCCTC............................CTTCTAGTCTCTCCAG；

C区为：ATATCCAGAACC.........................GGTTGTGGTCCAGC；

其中CDR3区为：

氨基酸序列C   A   E   N   L   Y   S   T   L   T   F

核苷酸序列tgt gca gag aac cta tac agc acc ctc acc ttt

重排方式：Vα15(又命名为：Vα5^*01)-N-Jα11^*01-Cα。

所述TCRVβ1基因序列如下：

ATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCAACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCTCTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCATTCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGATTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTAGCGGGAGGGgACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATATCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC；

所述TCRVβ1基因序列共930bp。其中：

V区为：ATGGGCTTCAGGC...................GCCAGCAGCGTAG；

D区为：CGGGAGGG；

J区为：ACGAGCAGTAC........................GGGCCGGGCAC；

C区为：AGGACCTGAAAA........................ATTCCAGAGGC；

其中CDR3区为：

氨基酸序列C   A   S   S   V   A   G   G   D   E   Q   Y   F

核苷酸序列tgt gcc agc agc gta gcg gga ggg gac gag cag tac ttc

重排方式：Vβ1(又命名为Vβ9^*01)-Dβ2^*02-N-Jβ2-7^*01-Cβ2。

利用上述TCR Vα15-pIRES-TCR Vβ1重组质粒构建抗EB病毒特异性细胞毒T细胞的方法，包括如下步骤：

(1)构建EBV特异性CTL克隆相关的TCR Vα-pIRES-TCR Vβ重组质粒：

(a)根据克隆性增殖的TCRVα15和TCRVβ1亚家族基因序列(包括完整的CDR3区)设计引物进行PCR反应，扩增TCR Vα15基因序列的上游引物上带有Xho I酶切位点、下游引物上带有EcoR I酶切位点，所用上游引物为：CGCTCGAGAAGCAGTGGTATTAACGCAGAGTC；所用下游引物为：TCGAATTCTCAGCTGGACCACAACCCGCAGCG，扩增TCR Vβ1基因序列的上游引物上带有Xba I酶切位点、下游引物上带有SalI酶切位点，上游引物为：CGTCTAGAAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTA；下游引物为：CGGTCGACCTAGCCTCTGGAATCCTTTCTCTT；分别获得全长的TCR Vα15和TCRVβ1亚家族基因PCR产物。

(b)将真核表达载体pIRES与纯化后的TCR Vα15 PCR产物分别用Xho I和EcoR I酶切，37℃水浴3h；双酶切后的pIRES载体和TCR Vα15 PCR产物进行连接反应：然后进行转化；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，用Xho I和EcoR I双酶切鉴定，同时在pIRES载体的IRES区设计一下游引物IRES-R(5’-TATAGACAAACGCACACCGG-3’)，结合pIRES载体上游的T7公共引物(5’-TACGACTCACTATAGGCTAG-3’)进行PCR鉴定，并对其进行双向测序鉴定，证实序列正确后扩增阳性克隆并提取质粒，获得EB病毒特异性细胞毒T细胞相关的TCR Vα15-pIRES重组质粒。

(c)将TCRVα15-pIRES质粒与纯化后TCRVβ1 PCR产物分别用Xba I和Sal I酶切，37℃水浴3h；双酶切后的TCR Vα15-pIRES质粒和TCR Vβ1PCR产物进行连接反应：再将连接产物(10μL)转入感受态大肠杆菌DH5α；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，分别用Xba I和Sa1 I以及Xho I和EcoR I两组双酶切鉴定；同时IRES区设计一上游引物IRES-F(5’-TAAAAAAACGTCTAGGCCCC-3’)，结合pIRES载体下游的T3公共引物(5’-TAACCCTCACTAAAGGGAAG-3’)进行PCR鉴定，再对其进行分段双向测序鉴定，证实质粒中所含TCR Vα15和TCR Vβ1序列均正确无误后，大量提取质粒，获得EB病毒特异性细胞毒T细胞相关的TCRVα15-pIRES-TCR Vβ1重组质粒。

(2)EBV特异性CTL克隆相关的TCR Vα-pIRES-TCR Vβ重组质粒转染T细胞，获得特异性识别EBV相关抗原的高效CTL：利用脂质体转染或电转染或核转染技术将EBV特异性TCR基因相关的TCR Vα15-pIRES-TCR Vβ1质粒转入T细胞中，培养扩增后获得抗EBV特异性CTL。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

由于血液肿瘤相关的TCR谱系优势利用和克隆性具有一定的特异性和倾向性，利用EB病毒抗原肽获得病毒特异性细胞毒T细胞克隆，进行T细胞克隆性分析后，将特异性细胞毒T细胞克隆优势表达的TCR Vα15和Vβ1基因转入真核表达载体，构建TCR Vα15-pIRES-TCR Vβ1重组质粒，再通过转基因技术将特异性TCR Vα15-pIRES-TCR Vβ1重组质粒转导到T细胞，从而得到大量EB病毒特异性细胞毒T细胞。通过嵌合TCR进行遗传学修饰T细胞，体外培养和扩增后获得特异性识别EB病毒抗原的大量特异性高效细胞毒T细胞，是可能有效治疗EB病毒相关的肿瘤或移植后并发症的过继性免疫治疗策略，可为EB病毒相关疾病的特异性免疫治疗提供新的治疗途径，具有较好的应用前景。本发明EB病毒特异性细胞毒T细胞克隆相关的TCRVα15-pIRES-TCR Vβ1重组质粒转导至外周血T细胞，可获得特异性识别EB病毒相关抗原的大量高效细胞毒T细胞，能够特异性地杀伤EBV⁺的细胞，安全性高，对EB病毒相关疾病的治疗有着较好的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1构建EB病毒特异性细胞毒T细胞克隆相关的TCR Vα-pIRES-TCR Vβ重组质粒；

首先由EB病毒相关抗原BMLF的九肽片段GLCTLVAML诱导正常人T细胞(HLA-A02限制性)并进行体外培养后获得EB病毒特异性细胞毒T细胞克隆，在含10％(v/v)胎牛血清、20U/mL重组人IL-2、100U/mL青-链霉素的IMDM培养基中，37℃、5％(v/v)CO₂饱和湿度培养箱内，常规体外培养扩增；然后收集EB病毒特异性细胞毒T细胞克隆1×10⁷个细胞，常规进行RNA提取、cDNA合成(按相应试剂盒说明书进行操作)，接着进行利用TCRVα和TCRVβ亚家族引物进行PCR扩增，分析EB病毒特异性细胞毒T细胞克隆中优势表达的TCR Vα和TCR Vβ亚家族，分别以29个TCR Vα亚家族和24个TCR Vβ亚家族相应的特异性上游引物，并结合相应Cα和Cβ下游引物，分别进行Vα1～29与Cα以及Vβ1～24与Cβ共53个PCR反应。PCR总反应体系20μL，其中含0-5μmol/L任一对Vα和Vβ引物、0.1mmol/L dNTP、1.25U Taq聚合酶、10×PCR缓冲液、1.5mmol/L MgCl₂、超纯水和1μL cDNA模板，同时设置阳性和阴性对照。反应在PCR扩增仪中进行，反应条件：94℃1min(首次为3 min)、60℃ 1min、72℃ 1min(末次为10min)，共40个循环，PCR产物保存于4℃中。取8μLPCR产物于2％琼脂糖凝胶中电泳后用Gene genius凝胶成像分析系统分析结果，出现阳性条带者进一步以荧光素标记的Cα-Fam引物或Cβ-Fam引物进行不对称扩增(10μL的反应体系含2.5μLTCR亚家族基因的PCR产物、0.15μmol/L Cα-Fam引物或Cβ-fam引物、1.5mmol/L MgCl₂、0.1mmol/L dNTP、0.75U Taq聚合酶、10×PCR缓冲液和超纯水。PCR反应条件：94℃ 1min(首次3min)、66℃ 1min、72℃ 1min(末次6min)，共35个循环)，得到荧光标记的单链PCR产物，再进行基因扫描分析(将高质量的去离子甲酰胺与Genescan-500 LIZ分子量标准品按20∶1比例配好10μL的混合液，加入2μL荧光素Fam标记的PCR产物，经94℃变性4min，立即放置冰上冷却2min，然后加入96孔板，直接装载到3100 DNA序列分析仪(ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer)上进行毛细管电泳，进行基因扫描分析)，确定其T细胞克隆性(涉及相关的引物序列如表1所示)。

表1  相关的引物序列

引物  序列Vβ1Vβ2Vβ3Vβ4Vβ5Vβ6Vβ7Vβ8Vβ9Vβ10Vβ11Vβ12Vβ13Vβ14Vβ15Vβ16Vβ17Vβ18Vβ19Vβ20Vβ21Vβ22Vβ23Vβ24CβCβ-FamVα1  5’-CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC  5’-GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA  5’-CGCTTCTCCCGGATTCTGGAGTCC  5’-TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA  5’-AGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC  5’-TCTCAGGTGTGATCCAAATTCGGG  5’-CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC  5’-CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC  5’-TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC  5’-CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC  5’-TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA  5’-TGTCACCAGACTGGGAACCACCAC  5’-CACTGCGGTGTACCCAGGATATGA  5’-GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCTAC  5’-CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG  5’-GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG  5’-CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC  5’-TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA  5’-TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA  5’-AGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTC  5’-TCCAACCTGCAAGGCTTGACGACT  5’-AAGTGATCTGCGCTGTGTCCCCA  5’-GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCA  5’-CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCC  5’-CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG  5’-Fam-CACAGCGACCTCGGGTGGG  5’-GGCATTAACGGTTTTGAGGCTGGA-3’

 Vα2 Vα3 Vα4 Vα5 Vα6 Vα7 Vα8 Vα9 Vα10 Vα11 Vα12 Vα13 Vα14 Vα15 Vα16 Vα17 Vα18 Vα19 Vα20 Vα21 Vα22 Vα23 Vα24 Vα25 Vα26 Vα27 Vα28 Vα29 Cα Cα-Fam  5’-CAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGT-3’  5’-CCGGGCAGCAGACACTGCTTCTTA-3’  5’-TTGGTATCGACAGCTTCACTCCCA-3’  5’-CGGCCACCCTGACCTGCAACTATA-3’  5’-TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCT-3’  5’-GCAACATGCTGGCGGAGCACCCAC-3’  5’-CATTCGTTCAAATGTGGGCAAAAG-3’  5’-CCAGTACTCCAGACAACGCCTGCA-3’  5’-CACTGCGGCCCAGCCTGGTGATAC-3’  5’-CGCTGCTCATCCTCCAGGTGCGGG-3’  5’-TCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCA-3’  5’-TTCATCAAAACCCTTGGGGACAGC-3’  5’-CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTT-3’  5’-TTGCAGACACCGAGACTGGGGACT-3’  5’-TCAACGTTGCTGAAGGGAATCCTC-3’  5’-TGGGAAAGGCCGTGCATTATTGAT-3’  5’-CAGCACCAATTTCACCTGCAGCTT-3’  5’-ACACTGGCTGCAACAGCATCCAGG-3’  5’-TCCCTGTTTATCCCTGCCGACAGA-3’  5’-AGCAAAATTCACCATCCCTGAGCG-3’  5’-CCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGA-3’  5’-TGCCTCGCTGGATAAATCATCAGG-3’  5’-CTGGATGCAGACACAAAGCAGAGC-3’  5’-TGGCTACGGTACAAGCCGGACCCT-3’  5’-AGCGCAGCCATGCAGGCATGTACC-3’  5’-AAGCCCGTCTCAGCACCCTCCACA-3’  5’-TGGTTGTGCACGAGCGAGACACTG-3’  5’-GAAGGGTGGAGAACAGATGCGTCG-3’  5’-GTTGCTCCAGGCCGCGGCACTGTT-3’  5’-Fam-ATACACATCAGAATCCTTACTTTG-3’

通过对单克隆增殖的亚家族(TCR Vα15和TCRVβ1亚家族)进行核苷酸序列分析，确定EB病毒特异性细胞毒T细胞克隆中克隆性增殖的TCRVα15和TCRVβ1亚家族基因序列；根据克隆性增殖的TCRVα15和TCRVβ1亚家族基因序列(包括完整的CDR3区)设计引物，扩增TCRVα15基因序列的上游引物上带有Xho I酶切位点、下游引物上带有EcoR I酶切位点(与真核表达载体pIRES中的插入位点A的酶切位点相对应，所用上游引物为：CGCTCGAGAAGCAGTGGTATTAACGCAGAGTC；所用下游引物为：TCGAATTCTCAGCTGGACCACAACCCGCAGCG)，扩增TCRVβ1基因序列的上游引物上带有Xba I酶切位点、下游引物上带有Sal I酶切位点(与真核表达载体pIRES中的插入位点B的酶切位点相对应，上游引物为：CGTCTAGAAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTA；下游引物为：CGGTCGACCTAGCCTCTGGAATCCTTTCTCTT)。按BD Advantage^TM 2 PCR试剂盒说明书进行PCR反应：PCR总反应体系50μL，其中含10×BD Advantage2 PCR Buffer、上下游引物各0.5μmol/L、dNTP Mix 0.2mmol/L、50×BDAdvantage 2 Polymerase Mix、超纯水和1μL cDNA模板，同时设置阳性和阴性对照。反应条件：94℃ 1min(首次为3min)、60℃ 1min、72℃ 2min(末次为7min)，共35个循环。

将真核表达载体pIRES与纯化后的TCR Vα15 PCR产物分别用Xho I和EcoR I酶切，37℃水浴3h；双酶切后的pIRES载体和TCRVα15 PCR产物进行连接反应：体系为：10×T4 bufferl μL、T4 DNA酶1μL、双酶切后的pIRES载体2μL、双酶切后的TCR Vα15 PCR产物6μL，混匀后置于16℃过夜；然后进行转化：①将连接产物(10μL)加入感受态大肠杆菌DH5α，置冰中30min；②42℃热休克90s后，迅速置冰中3min；③加入SOC培养基800μL，置干燥恒温振荡箱中37℃ 180～200rpm振摇60min；④菌液用玻璃推铺于1.5％LB固体培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)上，置37℃孵箱过夜培养；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，用Xho I和EcoR I双酶切鉴定，同时在pIRES载体的IRES区设计一下游引物IRES-R(5’-TATAGACAAACGCACACCGG-3’)，结合pIRES载体上游的T7公共引物(5’-TACGACTCACTATAGGCTAG-3’)进行PCR鉴定，PCR反应体系包括0.1mmol/L dNTP、1.5U Taq聚合酶、10×PCR缓冲液、1.5mmol/L MgCl₂和超纯水，引物浓度均为0.4μmol/L，以1∶500稀释的质粒DNA 1μL作为模板。PCR扩增条件为94℃ 3min，(94℃30s，60℃1min，72℃2min，35个循环)，72℃5min；并对其进行双向测序鉴定，证实序列正确后扩增阳性克隆并提取质粒，先获得EB病毒特异性细胞毒T细胞相关的TCR Vα15-pIRES重组质粒。

将TCR Vα15-pIRES重组质粒与纯化后TCRVβ1 PCR产物分别用Xba I和Sal I酶切，37℃水浴3h；双酶切后的TCR Vα15-pIRES重组质粒和TCRVβ1PCR产物进行连接反应：体系为：10×T4 buffer 1μL、T4 DNA酶1μL、双酶切后的TCRVα15-pIRES重组质粒2μL、双酶切后的TCRVβ1PCR产物6μL，混匀后置于16℃过夜；再将连接产物(10μL)转入感受态大肠杆菌DH5α，方法同前；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，分别用Xba I和Sal I以及Xho I和EcoR I两组双酶切鉴定，体系为：①TCR Vα15-pIRES-TCR Vβ1重组质粒3μL、Tango^TM buffer 4μL、Xba I和SalI内切酶各1.5μL、超纯水10μL；②TCR Vα15-pIRES-TCR Vβ1质粒3μL、Tango^TM buffer 4μL、Xho I和EcoR I内切酶各1.5μL、超纯水10μL；混匀后置于37℃水浴3h；同时IRES区设计一上游引物IRES-F(5’-TAAAAAAACGTCTAGGCCCC-3’)，结合pIRES载体下游的T3公共引物(5’-TAACCCTCACTAAAGGGAAG-3’)进行PCR鉴定，PCR反应体系和条件同前，再对其进行分段双向测序鉴定，证实质粒中所含TCR Vα15和TCR Vβ1序列均正确无误后，大量提取质粒，获得EB病毒特异性细胞毒T细胞相关的TCR Vα15-pIRES-TCR Vβ1重组质粒。

所构建质粒中pIRES载体的插入位点A内的片段序列长939bp(其中含TCR Vα15基因序列全长810bp以及部分非编码前导序列)，序列如下：

CTCGAGAAGCAGTGGTATTAACGCAGAGTCAGGGGGACCACAGTGCTTT

GGAGGAAAGGAAGAGATACTTGATAATATAGCTCTCTTGGCTGGAGATTG

CAGGTCCCAGTGGGGAGAACAATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTCC

TGTTTTTGTGGCTGCAGCTGGACTGTATGAGTAGAGGAGAGGATGTGGA

GCAGAGTCTTTTCCTGAGTGTCCGAGAGGGAGACAGCTCCGTTATAAAC

TGCACTTACACAGACAGCTCCTCCACCTACTTATACTGGTATAAGCAAGA

ACCTGGAGCAGGTCTCCAGTTGCTGACGTATATTTTTTCAAATATGGACA

TGAAACAAGACCAAAGACTCACTGTTCTATTGAATAAAAAGGATAAACA

TCTGTCTCTGCGCATTGCAGACACCCAGACTGGGGACTCAGCTATCTACT

TCTGTGCAGAGAacctATACAGCACCCTCACCTTTGGGAAGGGGACTATGC

TTCTAGTCTCTCCAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTG

AGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGA

TTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAG

ACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGC

CGCGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCTGTGCAAACGCCTTCACAC

AGCATTATTCCAAAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGA

TGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTT

CAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCG

GGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGTTGTGGTCCAGCTGAGAATTC。

其中，起始密码子：ATG，终止密码子：TGA；Xho I酶切位点：CTCGAG；

EcoR I酶切位点：GAATTC。

V区为：

ATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTCCTGTTTTTGTGGCTGCAGCTGGA

CTGTATGAGTAGAGGAGAGGATGTGGAGCAGAGTCTTTTCCTGAGTGTC

CGAGAGGGAGACAGCTCCGTTATAAACTGCACTTACACAGACAGCTCCT

CCACCTACTTATACTGGTATAAGCAAGAACCTGGAGCAGGTCTCCAGTTG

CTGACGTATATTTTTTCAAATATGGACATGAAACAAGACCAAAGACTCAC

TGTTCTATTGAATAAAAAGGATAAACATCTGTCTCTGCGCATTGCAGACA

CCCAGACTGGGGACTCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGA。

J区为：

ATACAGCACCCTCACCTTTGGGAAGGGGACTATGCTTCTAGTCTCTCCAG。

C区为：

ATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCC

AGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGT

GTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAG

ACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAA

CAAATCTGACTTTGCTGTGCAAACGCCTTCACACAGCATTATTCCAAAAG

ACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGA

GAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTG

ATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGTTGTGGTCCAGC。

其中CDR3区为：

氨基酸序列C   A   E   N   L   Y   S   T   L   T   F

核苷酸序列tgt gca gag aac cta tac agc acc ctc acc ttt

重排方式：Vα15(又命名为为：Vα5^*01)-N-Jα11^*01-Cα(包括外显子1、2、3)

所翻译的TCR Vα15基因的氨基酸序列如下：

MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSST

YLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQ

TGDSAIYFCAENLYSTLTFGKGTMLLVSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVC

LFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAAAWSNKSDFAV

QTPSHSIIPKDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVA

GFNLLMTLRLWSS。

其中，分子量为：MW(mono)＝30485.01226；MW(avg)＝30504.6118。

所构建质粒中pIRES载体的插入位点B内的片段序列长1023bp(其中含TCR Vβ1基因序列全长930bp以及部分非编码前导序列)，序列如下：

TCTAGAAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGAGAATGCTTACT

ACAGAGACACCAGCCCCAAGCTAGGAGATCCTGCCATGGGCTTCAGGCT

CCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTGGATTCTG

GAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCAACTGGACAGCGAG

TGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCTCTGTGTACTGGTAC

CAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCATTCAGTATTATAATGG

AGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGATTCTCCGCACAACA

GTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTGGAGCTGGGG

GACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTAGCGGGAGGGgACGAGC

AGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAA

ACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGAT

ATCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTAC

CCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCAC

AGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTC

AATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCT

TCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGG

GCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCAC

CCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACC

TCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGAT

CTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGC

TGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAGGTCGAC。

其中，起始密码子：ATG，终止密码子：TAG；Xba I酶切位点：TCTAGA；SalI酶切位点：GTCGAC。

V区为：

ATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGG

CCCAGTGGATTCTGGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCA

ACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCT

CTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCAT

TCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGA

TTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCT

CTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTAG。

D区为：CGGGAGGG。

J区为：ACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCAC。

C区为：

AGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATC

AGAAGCAGAGATATCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCC

ACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGA

AGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGC

AGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGT

CTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTC

CAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCA

AACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACT

GTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCAT

CCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCA

GTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC。

其中CDR3区为：

氨基酸序列C   A   S   S   V   A   G   G   D   E   Q   Y   F

核苷酸序列tgt gcc agc agc gta gcg gga ggg gac gag cag tac ttc

重排方式：Vβ1(又命名为Vβ9^*01)-Dβ2^*02-N-Jβ2-7^*01-Cβ2

所翻译的TCR Vβ1基因的氨基酸序列如下：

MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVAGGDEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG。

分子量为：MW(mono)＝34408.08665；MW(avg)＝34429.9602。

(2)TCRVα-pIRES-TCRVβ重组质粒转染T细胞；

以脂质体Lipofectamine^TM 2000转染为例：

①正常人T细胞培养：

分离正常人外周血单个核细胞后计数，取1×10⁶个细胞接种于50mL 25cm²的培养瓶中，培养总液量5mL，含15％(v/v)胎牛血清、500U/mL重组人IL-2、1μg/mL抗人CD3单抗、0.6μg/mL抗人CD28单抗、100U/mL青-链霉素的IMDM培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内常规培养；3～4天可传代，培养体系变为：15％胎牛血清、250U/mL重组人IL-2、100U/mL青-链霉素的IMDM培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内维持培养。

②TCR Vα-pIRES-TCR Vβ重组质粒转染正常人T细胞

将处于对数生长期的正常人T细胞以2×10⁶个细胞/孔的密度接种6孔板，取适量TCR Vα-pIRES-TCR Vβ重组质粒和脂质体Lipofectamine ^TM 2000混合后转染正常人T细胞，操作方法按转染试剂盒说明书，培养扩增后得到表达EB病毒特异性细胞毒T细胞相关TCR Vαβ基因的T细胞，再利用相应的TCRVα/Vβ亚家族引物进行实时定量PCR以及用相应的TCR Vα/Vβ亚家族单抗进行流式检测来验证重组质粒在转染后细胞中的表达。

(3)利用TCR Vα-pIRES-TCR Vβ重组质粒转染，获得特异性识别EB病毒相关抗原的高效细胞毒T细胞。

TCR Vα-pIRES-TCR Vβ重组质粒转染正常人T细胞后，以乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒分别在转染后第1周、第3周进行细胞毒性试验，操作按说明进行。分别以转染重组质粒的正常T细胞、转染空载体的正常T细胞为效应细胞，以Raji细胞(EBV⁺)、Molt4细胞(EBV-)为靶细胞，另设未转染质粒的正常T细胞为空白组。效靶比为10∶1，靶细胞浓度1×10⁴个细胞/孔，每组3个复孔；置U型96孔培养板内，稍离心2500rpm30s，以促进效、靶细胞之间接触，于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中孵育4h；用1000rpm离心5min，吸取上清100μL加入平底酶标板中，加入100μLLDH底物反应液，室温下避光作用30min，每孔加50μL1mol/L盐酸终止酶促反应；Elx-800酶标仪测定光密度(optical density，OD)值，测定波长490nm，参考波长670nm。细胞毒T细胞细胞毒活性计算公式：细胞毒T细胞活性(％)＝(实验组OD值-效应细胞自然释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)/(最大释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)。

发现转染重组质粒组、转染空载体组和空白组的细胞毒T细胞活性均随培养时间的延长而增强，转染重组质粒后第1周和第3周的T细胞对Raji细胞(EBV+)的杀伤活性为：4.64±0.07％和59.44±2.27％，转染空载体组T细胞第1周和第3周对Raji细胞的杀伤活性为：3.73±0.16％和28.23±0.23％，而空白组正常T细胞第1周和第3周对Raji细胞的杀伤活性为：1.39±0.47％和11.29±3.19％，说明在转染后第1周和第3周，转染重组质粒的T细胞对Raji细胞的杀伤活性均高于转染空载体的T细胞和空白组的正常T细胞(P值均＜0.05)。而转染重组质粒组、转染空载体组和空白组的T细胞对Molt4细胞(EBV-)的细胞毒活性按公式计算均为负值，故认为转染重组质粒组、转染空载体组和空白组的T细胞对Molt4细胞均无明显杀伤性；以上结果表明：转染TCR Vα-pIRES-TCR Vβ重组质粒的正常T细胞对EBV⁺细胞株具有特异性杀伤性，成功构建了抗EBV特异性细胞毒T细胞。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>EB病毒特异性TCR基因相关的重组质粒及构建抗EBV特异性CTL的方法

<130>31

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>810

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>TCRVα15基因序列

<400>1

atgaagacat ttgctggatt ttcgttcctg tttttgtggc tgcagctgga ctgtatgagt    60

agaggagagg atgtggagca gagtcttttc ctgagtgtcc gagagggaga cagctccgtt   120

ataaactgca cttacacaga cagctcctcc acctacttat actggtataa gcaagaacct   180

ggagcaggtc tccagttgct gacgtatatt ttttcaaata tggacatgaa acaagaccaa   240

agactcactg ttctattgaa taaaaaggat aaacatctgt ctctgcgcat tgcagacacc   300

cagactgggg actcagctat ctacttctgt gcagagaacc tatacagcac cctcaccttt   360

gggaagggga ctatgcttct agtctctcca gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac   420

cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct   480

caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta   540

gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgccgcgg cctggagcaa caaatctgac   600

tttgctgtgc aaacgccttc acacagcatt attccaaaag acaccttctt ccccagccca   660

gaaagttcct gtgatgtcaa gctggtcgag aaaagctttg aaacagatac gaacctaaac   720

tttcaaaacc tgtcagtgat tgggttccga atcctcctcc tgaaagtggc cgggtttaat   780

ctgctcatga cgctgcggtt gtggtccagc                                    810

<210>2

<211>930

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>TCRVβ1基因序列

<400>2

atgggcttca ggctcctctg ctgtgtggcc ttttgtctcc tgggagcagg cccagtggat     60

tctggagtca cacaaacccc aaagcacctg atcacagcaa ctggacagcg agtgacgctg    120

agatgctccc ctaggtctgg agacctctct gtgtactggt accaacagag cctggaccag    180

ggcctccagt tcctcattca gtattataat ggagaagaga gagcaaaagg aaacattctt    240

gaacgattct ccgcacaaca gttccctgac ttgcactctg aactaaacct gagctctctg    300

gagctggggg actcagcttt gtatttctgt gccagcagcg tagcgggagg ggacgagcag    360

tacttcgggc cgggcaccag gctcacggtc acagaggacc tgaaaaacgt gttcccaccc    420

gaggtcgctg tgtttgagcc atcagaagca gagatatccc acacccaaaa ggccacactg    480

gtatgcctgg ccacaggctt ctaccccgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaatggg    540

aaggaggtgc acagtggggt cagcacagac ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc    600

aatgactcca gatactgcct gagcagccgc ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac    660

ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg    720

acccaggata gggccaaacc cgtcacccag atcgtcagcg ccgaggcctg gggtgagca     780

gactgtggct tcacctccga gtcttaccag caaggggtcc tgtctgccac catcctctat    840

gagatcttgc tagggaaggc caccttgtat gccgtgctgg tcagtgccct cgtgctgatg    900

gccatggtca agagaaagga ttccagaggc                                     930

<210>3

<211>270

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>所翻译的TCRVα15基因的氨基酸序列

<400>3

Met Lys Thr Phe Ala Gly Phe Ser Phe Leu Phe Leu Trp Leu Gln Leu

1               5                   10                  15

Asp Cys Met Ser Arg Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser

          20                  25                    30

Val Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser

        35                  40                   45

Ser Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu

    50                   55                  60

Gln Leu Leu Thr Tyr Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln

65                  70                  75                  80

Arg Leu Thr Val Leu Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg

                85                  90                  95

Ile Ala Asp Thr Gln Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu

            100                 105                   110

Asn Leu Tyr Ser Thr Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Met Leu Leu Val

      115                   120                 125

Ser Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp

    130                 135                   140

Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser

145                 150                 155                 160

Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp

                165                 170                    175

Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala

            180                 185                 190

Ala Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Val Gln Thr Pro Ser His

        195                 200                  205

Ser Ile Ile Pro Lys Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys

    210                   215                 220

Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn

225                 230                 235                 240

Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val

                245                 250               255

Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

            260               265                   270

<210>4

<211>310

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>所翻译的TCRVβ1基因的氨基酸序列

<400>4

Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Lgu Gly Ala

1             5                   10                  15

Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr

            20                   25                  30

Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp

        35                  40                  45

Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe

    50                   55                  60

Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu

65                   70                  75                  80

Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn

                85                  90                  95

Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser

            100                 105                 110

Ser Val Ala Gly Gly Asp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

        115                 120                 125

Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val

    130                 135                 140

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu

145                 150                  155                160

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

                165                 170                 175

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln

            180                 185                 190

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser

        195                 200                 205

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His

    210                 215                 220

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp

225                 230                 235                 240

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala

                245                 250                  255

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly

            260                 265                 270

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr

        275                 280                  285

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys

    290                 295                  300

Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305                 310