里氏木霉的紫外诱变和高活性纤维素酶突变株的选育

摘要

以纤维素、半纤维素和木质素形式存在的生物质原料数量丰富，发展和利用生物质能源是实现经济、社会可持续发展的有效途径。在生物质原料转化利用方面，里氏木霉(Trichoderma reesei)是产纤维素酶的重要菌种之一，其生产的纤维素酶在能源、生物防治、食品等多个领域都得到了广泛的应用。本研究通过对里氏木霉进行紫外诱变，以筛选出高产纤维素酶的突变菌株，进一步提高其纤维素酶的产量，降低生产成本为目的。
　　 本文基于筛选高产纤维素酶突变菌株的目的，对里氏木霉Rut C30进行紫外诱变，筛选突变菌株，并对其突变菌株的产酶条件进行优化，通过随机扩增多态性DNA(RAPD)对出发菌株和突变菌株的基因组进行分析。
　　 对T．reesei Rut C30的孢子悬液进行紫外线诱变，确定最佳诱变时间为40s，该剂量下致死率为83．500％，正突变率为8．679％，以刚果红筛选培养基上水解圈与菌落直径的比值(H/d)为指标，进行初筛，再以液体发酵产酶进行复筛，最终获得了一株突变株A13，其滤纸酶活为4．328U/ml，相较于出发菌株2．786U/ml的酶活，提高了55．350％。对突变株A13进行6代连续培养，酶活稳定在4．160U/ml，其遗传稳定性较好。
　　 通过碳源、复合氮源、产酶温度这三个单因素优化实验，获得了突变菌株A13产酶的最佳条件，以1．000％微晶纤维素为碳源、0．150％蛋白胨与0．050％硫酸铵为复合氮源，产酶温度为28℃的条件下，突变菌株A13的滤纸酶活为4．915U/ml，比优化前的4．160U/ml提高了18．150％。
　　 在含有微晶纤维素的产酶培养基中添加适量的麦芽浸粉，实验表明，麦芽浸粉确实能促进里氏木霉的突变株产出更多的纤维素酶。当在1．000％微晶纤维素的基础上添加1．000％麦芽浸粉时，滤纸酶活提高到了5．720U/ml。采用中心复合实验设计，寻找微晶纤维素与麦芽浸粉的最佳配比。对中心复合实验设计的实验结果进行响应面分析，结果表明，在优化后的产酶条件下，当微晶纤维素和麦芽浸粉分别为13．19g/L和11．03g/L时，实际测定的滤纸酶活可以达到5．986U/ml，接近软件预测的最大值6．082U/ml。
　　 对出发菌株及4株突变菌株的基因组DNA进行RAPD分析，并对RAPD—PCR的反应体系进行优化。筛选出6个随机引物后，对它们的扩增条带进行聚类分析，结果显示这5株菌的遗传相似系数在0．6046512—0．8837209之间，表明它们之间有较近的亲缘关系，但存在一定的遗传变异。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 引言

1.1.1 生物质能源

1.1.2 利用生物质的微生物

1.2 木霉属及其纤维素酶

1.2.1 木霉属的发展史

1.2.2 木霉菌的形态特征

1.2.3 里氏木霉

1.2.4 纤维素酶

1.2.5 纤维素酶的作用机制

1.3 木霉属及其酶的应用

1.3.1 在生物防治上的应用

1.3.2 在工业上的应用

1.4 诱变机理

1.4.1 物理诱变剂

1.4.2 化学诱变剂

1.5 里氏木霉的高产诱变突变株选育

1.5.1 T.reesei RUT C30

1.5.2 T.reesei RL P37

1.5.3 其他突变株

1.6 突变机制

1.6.1 基因组的特点

1.6.2 高产突变株的基因变异

1.7 本研究的意义和主要内容

1.7.1 本研究的意义

1.7.2 本研究的主要内容

第二章 紫外诱变里氏木霉

2.1 实验材料

2.1.1 菌种

2.1.2 试剂

2.1.3 培养基

2.1.4 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 孢子悬液的制备

2.2.2 诱变剂量的选择

2.2.3 紫外诱变

2.2.4 突变株的初筛

2.2.5 突变株的复筛

2.2.6 突变株的产酶培养

2.2.7 分析方法

2.3 结果与分析

2.3.1 诱变剂量的选择

2.3.2 诱变后初筛菌落形态

2.3.3 突变株的初筛

2.3.4 突变株的复筛

2.3.5 突变株的遗传稳定性

2.4 小结

第三章 突变株液体发酵产酶培养基的优化

3.1 实验材料

3.1.1 菌种

3.1.2 试剂

3.1.3 培养基

3.1.4 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 单因素实验

3.2.2 摇瓶产酶实验

3.2.3 中心复合实验设计优化培养基

3.2.4 分析方法

3.3 结果与分析

3.3.1 碳源对产酶活力的影响

3.3.2 复合氮源对产酶活力的影响

3.3.3 产酶温度对产酶活力的影响

3.3.4 产酶培养基优化

3.4 小结

第四章 里氏木霉及其突变株的RAPD分析

4.1 实验材料

4.1.1 菌种

4.1.2 培养基

4.1.3 DNA提取用主要试剂

4.1.4 RAPD及PCR试剂

4.1.5 电泳及其检测用试剂

4.1.6 RAPD引物

4.1.7 实验仪器

4.2 实验方法

4.2.1 Rut C30及其突变株的培养

4.2.2 Rut C30及其突变株基因组DNA的提取

4.2.3 PCR扩增反应

4.2.4 RAPD体系的优化

4.2.5 RAPD引物的筛选检测

4.2.6 出发菌株与突变菌株的比较分析

4.3 结果与分析

4.3.1 Rut C30及其突变株的基因组DNA

4.3.2 DNA模板浓度对PARD扩增的影响

4.3.3 Mg2+浓度对PARD扩增的影响

4.3.4 dNTPs浓度对PARD扩增的影响

4.3.5 引物浓度对PARD扩增的影响

4.3.6 Taq聚合酶浓度对PARD扩增的影响

4.3.7 优化后的RAPD-PCR反应体系

4.3.8 RAPD结果分析

4.4 小结

第五章 结论和创新

参考文献

附录 A 缩略词表

附录 B DNA Marker

附录 C 攻读硕士学位期间的主要学术成果

致谢