RNAi介导沉默IGF-IR抑制胃癌细胞BGC823生长及侵袭转移的体外研究

摘要

第一章IGF-IR在人胃癌中的表达及临床意义 目的：探讨IGF-IR在人胃癌组织中的表达及临床意义。 方法：采用RT-PCR和Western blot.方法检测50例手术切除胃癌、癌旁及手术切缘非癌组织中IGF-IRmRNA和蛋白的表达。采用免疫组化的方法检测113例手术切除胃癌组织及30例胃镜下活检非癌胃粘膜上皮组织中IGF-IR的表达。结合胃癌患者临床病理特征和术后生存随访资料分析临床意义。 结果：在50例新鲜标本中，92.0％(46/50)的胃癌组织，62.0％(31/50)的癌旁组织以及56.0％(28/50)的非癌组织中可检测到IGF-IR mRNA的表达。胃癌组织中IGF-IR mRNA的平均表达水平明显高于癌旁及非癌组织(2.25±0.43 vs.2.02±0.16 & 1.93±0.46，P<0.05)。而IGF-IRmRNA在癌旁组织中的表达略高于非癌组织无显著性差异(P=0.34)。Western blot结果显示：在86.0％(43/50)的胃癌组织中，60.0％(30/50)的癌旁组织和58.0％(29/50)的非癌组织中可以检测到IGF-IR蛋白的表达，GC中IGF-IR蛋白的阳性表达率显著高于PC和NC(P<0.01)。半定量分析IGF-IR蛋白在胃癌组织中的平均表达水平明显高于癌旁和非癌组织(1.86±0.30 vs.1.72±0.24 & 1.14±0.10，P<0.01)；而其在癌旁组织中的表达也较非癌组织中高(P<0.01)。IGF-IR mRNA和蛋白的表达水平与胃壁浸润深度、区域淋巴结转移、临床病理分期(TNM分期)密切相关(P<0.05)。免疫组化检测显示：IGF-IR蛋白染色定位与细胞膜和细胞浆，在非癌胃粘膜上皮细胞中IGF-IR蛋白阳性表达率为66.7％(20/30)且多为弱阳性染色，而在胃癌细胞内阳性表达率为72.6％(82/113)呈现粗大的棕色的强阳性染色，IGF-IR蛋白在胃癌细胞的表达明显增强(P<0.01)。IGF-IR蛋白在胃癌组织中的表达与患者性别、年龄、癌灶原发部位、幽门螺杆菌感染与否以及有无远处转移无关(P>0.05)；与胃壁浸润深度、区域淋巴结转移、胃癌细胞的组织分化程度有关(P<0.05)，IGF-IR在Ⅲ+Ⅳ期患者胃癌细胞中表达明显强于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)。生存率分析显示，113例胃癌患者手术后平均生存时间为44.6月，中位生存时间为39.0月。组间比较IGF-IR高表达组胃癌患者手术后生存率明显降低(P<0.05)。 结论：1.IGF-IR在胃癌组织中表达上调，与在非胃癌组织中的表达存在显著性差异，IGF-IR表达与癌细胞分化程度、区域淋巴结转移数目、胃壁浸润深度及患者临床病理分期密切相关；提示IGF-IR可能参与了胃癌的发生发展；2.IGF-IR蛋白过量表达与胃癌患者预后不良密切相关，IGF-IR可能成为反映胃癌预后的一个新的肿瘤标志物。 第二章靶向IGF-IR的逆转录病毒siRNA表达载体的构建 目的：构建靶向IGF-IR的siRNA表达载体，并进一步研究其对人胃癌细胞BGC823的IGF-IR表达的抑制效应。 方法：利用逆转录pSUPER/H1质粒构建IGF-IR特异性siRNA表达载体和对照组表达载体，并用PCR电泳及基因测序予以鉴定。IGF-IR特异性siRNA表达载体以脂质体法转染胃癌细胞BGC823，48小时后用RT-PCR，Westernblot法分别检测IGF-IRmRNA和蛋白的表达水平。 结果：成功构建靶向IGF-IR的siRNA表达载体和对照组表达载体，分别命名为pSUPER-IGF-IR-siRNAl，pSUPER-IGF-IR-siRNA2和pSUPER-Control-siRNA。pSUPER-IGF-IR-siRNAl和pSUPER-IGF-IR-siRNA2转染组IGF-IRmRNA和IGF-IR蛋白的表达量明显低于pSUPER-Control-siRNA转染组及PBS处理的阴性对照组(P<0.05)。 结论：利用逆转录病毒载体成功构建了有效沉默胃癌细胞IGF-IR目的基因的siRNA质粒。 第三章 IGF-IR干扰对胃癌BGC823细胞生物学行为的影响 目的：研究RNAi介导IGF-IR基因沉默对胃癌细胞BGC823增殖、凋亡及侵袭转移的影响。 方法：用靶向IGF-IR的siRNA质粒表达载体转染胃癌细胞0h、 24h、48h、72h，用MTT法检测BGC823细胞的增殖活性。IGF-IR特异性siRNA表达载体转染BGC823细胞48h，并用流式细胞技术检测细胞周期的变化，同时应用PI染色、DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡；用细胞侵袭实验、划痕愈合实验评价BGC823侵袭转移能力的变化。 结果：IGF-IR特异性siRNA表达载体转染胃癌细胞后24h，细胞增殖无明显变化，48h、72h活细胞数明显减少，且抑制率分别为62.15±0.98％和59.82±0.68％明显增高(P<0.05)，但48h和72h组间比较无显著性差异(P>0.05)。分析细胞周期变化在第48小时，G0/G1期，S期和G2/M期的细胞百分比分别为59.42±4.01％，37.83±2.13％和3.71±0.18％，较pSUPER-Control-siRNA与PBS处理的阴性对照组G1期细胞数明显增多(P<0.05)。细胞侵袭实验中pSUPER-IGF-IR-siRNA2转染组穿过人工膜的细胞数量显著少于pSUPER-Control-siRNA及PBS阴性对照组(98.33±1 1.37 vs.128.33±5.69 &135.33±7.77) (p<0.05)。划痕愈合实验中，划痕后12h开始愈合距离出现明显差异，划痕后36小时细胞计数显示，pSUPER-IGF-IR-siRNA2转染组细胞显著少于pSUPER-Control-siRNA组及PBS阴性对照组为(58.00±1 1.00 vs.1 16.67±12.10&122.67±11.15) (P<0.05)。划痕后36h，pSUPER-Control-siRNA组及PBS阴性对照组划痕已基本愈合，而pSUPER-IGF-IR-siRNA2转染组只愈合了约40％。 结论： 1.IGF-IR在胃癌细胞BGC823的高表达可能在抑制胃癌细胞凋亡，促进胃癌细胞的增殖中起重要作用；2.IGF-IR沉默表达可显著抑制BGC823细胞侵袭运动转移潜能，IGF-IR可能在调控胃癌发生侵袭转移过程中其关键性作用。 第四章基于免疫共沉淀.免疫印迹.质谱技术鉴定胃癌中IGF-IR作用分子的研究 目的：探讨IGF-IR蛋白相互作用的功能蛋白，研究IGF-IR在胃癌细胞中的调控作用机制。 方法：利用免疫共沉淀和质谱分析技术相结合，先采用免疫共沉淀技术从胃癌BGC823细胞中富集IGF-IR结合蛋白，再采用SDS-PAGE电泳技术对含IGF-IR结合蛋白的复合物进行分离，染色，切取差异蛋白条带，经脱色、还原、烷基化、原位酶解、样品萃取、脱盐及点样，然后采用ESI-MS/MS分析，分析结果peaklist文件输入Mascot查询系统进行检索查询。 结果：获得包括sorcin蛋白在内的24个蛋白点结果数据。 结论：利用免疫共沉淀和质谱技术相结合分析胃癌细胞中IGF-IR相互作用蛋白具有可行性。IGF-IR和Sorcin蛋白相互作用的机制可能和胃癌的发生发展及胃癌细胞耐药有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词简表

声明

前言

第一章IGF-IR在胃癌组织中的表达及临床意义

前言

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

4.结论

附图表

第二章靶向IGF-IR的逆转录病毒siRNA表达载体的构建

前言

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

附图

第三章IGF-IR干扰对胃癌细胞BGC823肿瘤生物学行为的影响

前言

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

附图表

第四章基于免疫共沉淀-免疫印迹-质谱技术鉴定胃癌中IGF-IR作用分子的研究

前言

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

4.结论

附图

参考文献

综述 IGF-IR与肿瘤发生发展的研究进展

致谢

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