RNAi抑制NRP2表达对胃癌细胞SGC7901生长及侵袭转移的实验研究

摘要

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，死亡率在世界范围恶性肿瘤中占第二位。我国是胃癌高发国家，胃癌位居所有恶性肿瘤死亡第一位。胃癌临床表现为进展快、预后差，早发现、早诊断、早治疗是降低胃癌死亡率的关键手段。遗憾的是绝大多数患者就诊时已是进展期，早期胃癌所占比例不足10％。研究发现2～4％的粘膜内胃癌、10～15％的粘膜下胃癌、80％的进展期胃癌有远处淋巴结转移，胃癌的预后与癌组织浸润深度及是否发生了淋巴结转移相关。目前研究认为，肿瘤相关淋巴管的形成能够促进肿瘤的转移扩散，所以现在有很多研究聚焦于如何抑制肿瘤环境下淋巴管的形成。VEGFR3是第一个被验证的淋巴管生成的特异性标记物，VEGFR3是淋巴管内皮生长刺激因子VEGFC的特异性受体。VEGFC与其受体VEGFR3结合后可引起淋巴管内皮细胞增殖、迁移及抑制内皮细胞凋亡，从而发挥促进淋巴管新生的作用。　　 神经纤毛蛋白（Neuropilins，NRPs）是一种跨膜糖蛋白，最初是作为轴突导向分子Semaphorin的受体而发现，在神经系统的发育过程中起着重要调节作用，进一步研究证明NRPs在肿瘤的生长转移中也起着关键的作用。NRPs家族包括NRPI和NRP2两个成员。Maresa Caunt等最新研究认为NRP2参与了VEGFC诱导的淋巴管内皮细胞迁移和淋巴管新生（特别是肿瘤相关的新生功能性淋巴管）功能，在肿瘤动物模型中阻断NRP2功能发现肿瘤转移至哨兵淋巴结和远隔器官减少的现象。淋巴结转移是胃癌的一个重要的生物学特性，胃癌经淋巴道发生局部和远处转移是导致患者预后差的重要因素之一，NRP2是否参与胃癌发生及淋巴结转移，其作用机制如何是本课题需验证的设想。　　 目的：检测不同胃癌细胞株中NRP2的表达，通过体外实验和裸鼠体内实验了解我们构建的RNA干扰表达载体能否特异性的干扰胃癌细胞中NRP2基因并影响胃癌细胞的生物学特性及移植瘤中淋巴管的生成。　　 方法：　　 1.采用RT-PCR、Western blot方法在mRNA和蛋白水平检测NRP2在胃癌细胞株BGC823、SGC7901的表达。　　 2.利用计算机辅助设计软件，设计合成含有针对NRP2基因特定序列的寡核苷酸片段，并将其定向克隆入真核表达载体，得到重组质粒shRNA-NRP2-1、shRNA-NRP2-2、shRNA-NRP2-3和阴性对照质粒shRNA-HK。　　 3.用脂质体法转染胃癌细胞株SGC7901，应用半定量RT-PCR、Western blot法检测转染前后NRP2mRNA和蛋白表达的情况，筛选出最佳干扰质粒。　　 4.采用流式细胞仪、侵袭小室实验等检测shRNA2-2转染前后SGC7901细胞的增殖、细胞周期、凋亡、侵袭、迁移能力，并用半定量RT-PCR技术检测转染前后SGC7901细胞CXCR4的表达。　　 5.裸鼠皮下接种胃癌细胞SGC7901成瘤，分为干扰组、阴性对照组及空白对照组三组，成瘤后三组裸鼠分别皮下注射shRNA-NRP2-2、shRNA-HK、PBS，不同时间点测定肿瘤体积和裸鼠体重的差异，连续观察6周，肿瘤组织切片免疫组化检测NRP2蛋白变化及计数淋巴管的密度（MLD），评价体内环境中NRP2RNAi表达载体对肿瘤细胞及淋巴管生成的影响。　　 结果：　　 1.两株细胞均有NRP2表达，BGC823、SGC7901细胞中NRP2蛋白的相对含量分别是0.63±0.02、0.85±0.03，两者差别有显著性（P<0.05。BGC823、SGC7901细胞中NRP2mRNA的相对含量是0.56±0.01、0.86±0.03，两者差别有显著性（P<0.05）。SGC7901细胞中NRP2表达水平更高。　　 2.经酶切和测序分析证明成功构建了NRP2小分子RNA干扰表达载体。　　 3.重组质粒转染SGC7901细胞后，经Western blot检测，NRP2/β-actin吸光度比值：质粒NRP2-1、NRP2-2、NRP2-3分别为0.68±0.01、0.34±0.03、0.58±0.01，HK组和空白组分别为0.89±0.02和0.91±0.03。三组质粒对NRP2蛋白表达的抑制率分别为31.5％、63.2％和49.6％；经RT-PCR检测，NRP2/β-actin吸光度比值：质粒NRP2-1、NRP2-2、NRP2-3分别为0.63±0.02、0.51±0.02、0.61±0.01；HK组为0.95±0.01，空白组为0.97±0.01。三组质粒对NRP2mRNA的抑制率分别为36.3％、57.4％和37.2％。质粒NRP2-2抑制NRP2表达的效应最佳，与质粒NRP2-1和NRP2-3相比，有显著性差异（P<0.05）。　　 4.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡实验表明，与HK阴性对照组和空白对照组相比，NRP2干扰组G0/G1期细胞百分比显著升高，S期细胞减少，细胞凋亡率增加；Transwell小室侵袭和迁移实验表明NRP2干扰组细胞侵袭和迁移能力明显低于HK阴性对照组和空白对照组；NRP2干扰组CXCR4mRNA表达明显低于HK阴性对照组和空白对照组。　　 5.与HK阴性对照组和空白对照组相比，体内实验中Western blot与免疫组化检测NRP2干扰组NRP2蛋白表达明显降低，与体外实验一致，裸鼠移植瘤的体积、重量及微淋巴管密度在NRP2干扰组也明显受抑制。　　 结论：　　 1.NRP2特异性RMA干扰敲低SGC7901细胞NRP2表达后，可抑制细胞体外增殖、侵袭、迁移能力，诱导细胞凋亡。　　 2.裸鼠皮下胃腺癌移植瘤模型应用shRNA2-2处理后，同样可有效沉默NRP2的表达，同时移植瘤的体积、重量及MLD也受到明显抑制。　　 3.NRP2可能通过调控CXCR4的表达影响胃癌的淋巴结转移。