糖皮质激素诱导成骨细胞凋亡的机制探讨

摘要

目的:糖皮质激素(GC)诱导成骨细胞凋亡是糖皮质激素诱导的骨质疏松(GIOP)的主要细胞学基础。最近的研究发现,金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)可抗鼠骨髓间质细胞系MBA-1(前成骨细胞)的凋亡。所以,我们测试了地塞米松(Dex)对小鼠胚胎成骨细胞系MC3T3-E1细胞中TIMP-1的影响,探讨GC诱导成骨细胞凋亡的机制。
　　方法:小鼠胚胎成骨细胞系MC3T3-E1细胞放入适当的培养基及环境中培养,以10-6~10-9mol/L Dex(Dex干预组)、10-6mol/LDex+10-5mol/L糖皮质激素受体拮抗剂RU486(GR拮抗剂组)、200~1000ng/ml TIMP-1+10-6mol/L Dex(TIMP-1干预组)干预。对Dex干预组及GR拮抗剂组应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RTQ-PCR)检测TIMP-1 mRNA的表达;用蛋白质免疫印迹法(Westernblot)和酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测细胞和培养基中的TIMP-1蛋白水平。应用细胞凋亡ELISA试剂盒和酶底物法分别检测Dex干预组及TIMP-1干预组的胞质核小体及半胱天冬酶-3(Caspase-3)的活化水平。
　　结果:1.RTQ-PCR结果表明,Dex降低了MC3T3-E1细胞TIMP-1 mRNA的表达水平,并呈剂量依赖效应。2.蛋白质免疫印迹法检测结果显示,Dex抑制MC3T3-E1细胞TIMP-1蛋白的表达,并呈剂量和时间依赖效应。3.TIMP-1 ELISA检测结果显示,Dex抑制MC3T3-E1细胞TIMP-1的分泌,并呈剂量和时间依赖效应。4.利用GR拮抗剂米非司酮(RU486)探讨Dex是否通过GR途径介导TIMP-1的作用,结果发现10-5M RU486可拮抗Dex对TIMP-1的抑制作用。5.Dex诱导MC3T3-E1细胞凋亡,并呈剂量依赖效应。6.重组TIMP-1可减少Dex(10-6mol/L)诱导的MC3T3-E1细胞凋亡,呈剂量依赖效应。
　　结论:GC如Dex抑制成骨细胞TIMP-1的表达与其诱导成骨细胞凋亡密切相关。TIMP-1是GC对骨合成负效应的中介因子之一。

目录

中文摘要

英文摘要

缩略词

第一章 前言

第二章 材料与方法

2.1 仪器与试剂

2.2 细胞培养及干预实验

2.3 RTQ-PCR检测TIMP-1 mRNA的表达

2.4 蛋白质免疫印迹法检测TIMP-1的蛋白水平

2.5 ELISA法检测TIMP-1的分泌

2.6 ELISA法检测核小体

2.7 荧光酶联免疫吸附法检测caspase-3的活性

2.8 统计分析

第三章 结果

3.1 Dex剂量依赖性抑制MC3T3-E1细胞TIMP-1 mRNA的表达

3.2 Dex剂量、时间依赖性抑制MC3T3-E1细胞的TIMP-1蛋白表达

3.3 Dex剂量、时间依赖性抑制MC3T3-E1细胞TIMP-1的分泌

3.4 GR拮抗剂可阻滞Dex对TIMP-1表达的抑制作用

3.5 Dex剂量依赖性诱导MC3T3-E1细胞凋亡

3.6 重组TIMP-1剂量依赖性减少Dex诱导的MC3T3-E1细胞凋亡

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述

致谢