二甲基精氨酸-二甲胺水解酶对内皮祖细胞衰老的调控与糖尿病血管功能障碍

摘要

第一章、二甲基精氨酸-二甲胺水解酶对内皮祖细胞分化及功能的调控作用
　　 背景：
　　 内皮祖细胞是一类能分化为成熟的内皮细胞及心肌细胞,促进血管新生和改善心功能的干细胞。EPCs参与血管修复和血管新生,为治疗缺血性疾病提供了新的策略。
　　 血管内皮生长因子是调节EPCs功能最强的因子。VEGF与2型VEGF受体(KDR)相互作用而调节EPCs功能,包括内皮修复与血管新生。
　　 二甲基精氨酸-二甲胺水解酶能特异性的水解L-精氨酸的同类物非对称二甲基精氨酸。ADMA是一种主要的内源性一氧化氮合酶抑制物,能竞争性抑制NOS,减少一氧化氮合成。研究发现,内皮细胞衰老和血管新生涉及DDAH/ADMA途径。
　　 人类沉默信息调节因子2(Silent information regulator2,Sir2)SIRT1是Ⅲ型组蛋白去乙酰化蛋白,能引起基因表达沉默。研究发现,SIRT1通过DDAH/ADMA途径抑制内皮细胞衰老。文献报道,高糖诱导EPCs衰老涉及SIT1途径。
　　 基于DDAIMADMA与SIRT1参与血管新生及细胞衰老的调节以及SIRT1介导DDAH/ADMA途径的效应,我们推测DDAH/ADMA可能通过VEGF/KDR途径参与EPCs分化与功能的调控,该作用可能涉及SIRT1途径。因此,本实验在体外培养人外周血来源EPCs研究了DDAH/ADMA对EPCs功能与衰老的影响。
　　 方法：
　　 EPCs培养与鉴定:梯度离心加选择性粘附分离健康人外周血EPCs,用内皮基础培养基EBM-2培养EPCs。培养7天后鉴定,包括乙酰化低密度脂蛋白与荆豆凝集素1双染鉴定分化EPCs;流式细胞仪检测细胞CD133、CD34、CD45、KDR、vWF等标记物表达。
　　 DDAH对EPCs分化及功能调控及机制:提取分化第7天的EPCs,检测DDAH1和DDAH2表达;提取第7和17天EPCs,检测JDDAH2、SIRT1表达。为了探讨DDAH2对EPCs功能的调控,运用pGCSIL-GFP-hDDAH2慢病毒转染EPCs沉默DDAH2表达;为了探讨SIRT1对DDAH2表达的调控,运用pGCSIL-GFP-hSIRT1慢病毒转染EPCs沉默SIRT1表达。提取细胞mRNA,Real-time PCR检测DDAH1、DDAH2、SIRT1、VEGF和KDR mRNA表达;流式细胞仪和WesternBlot检测DDAH2和SIRT1蛋白表达;高效液相色谱法(highperformance liquid chromatography,HPLC)检测细胞上清ADMA;β-半乳糖苷酶活性评价EPCs衰老程度:tubedx管形成实验评价EPCs血管形成能力;纤维连接蛋白检测EPCs粘附能力。
　　 结果：
　　 人外周血EPCs主要以DDAH2亚型表达为主,且随着EPCs分化时间延长而增加。
　　 结论：
　　 DDAH2参与EPCs分化过程,并通过调节VEGF/KDR途径抑制EPCs的衰老,其作用机制涉及SIRT1途径。
　　 第二章、二甲基精氨酸一二甲胺水解酶/非对称二甲基精氨酸在2型糖尿病内皮祖细胞衰老中的作用及机制
　　 研究背景
　　 血管病变是糖尿病主要并发症之一。临床与动物实验发现糖尿病时,EPCs衰老率显著增加、功能受损。高糖能诱导EPCs衰老、血管形成能力减弱,导致糖尿病血管功能减弱、侧枝循环建立减少,引发心血管疾病。
　　 ADMA是一种新的心血管疾病预测因子,是内源性NOS抑制物,能竞争性抑制NOS,减少NO的合成。糖尿病时,细胞DDAH2表达降低、活性减弱,引起ADMA浓度增加并抑制NO生成。临床与动物实验证明,糖尿病时EPCs功能受损与NO浓度降低有关。细胞实验证明,ADMA能直接损伤EPCs功能。
　　 糖尿病或高糖孵育EPCs时,EPCs SIRT1表达下调,同时伴随细胞衰老和血管形成功能减退。内皮细胞实验发现,SIRT1可上调DDAH2表达,增加活性,促进ADMA水解,抑制内皮细胞自然衰老过程。
　　 本实验在2型糖尿病患者与培养EPCs细胞探讨了EPCs衰老与DDAH/ADMA之间的关系,以及该过程是否涉及SIRT1途径。
　　 方法：
　　 临床研究:对照组与2型糖尿病患者组各40例。取外周静脉血,分离血浆与细胞。HPLC检测血浆ADMA浓度;梯度离心加粘附分离细胞EPCs,β-半乳糖苷酶活性评价细胞衰老,Real-time PCR法检测细胞DDAH2、SIRT1 mRNA表达。
　　 细胞实验:外源性给予葡萄糖(10,20,30 mmol/L)孵育EPCs建立高糖损伤EPCs细胞模型,以甘露醇(10,20,30 mmol/L)作为渗透压对照组,探讨高糖诱导EPCs衰老;构建pGC-FU-hDDAH2慢病毒探讨DDAH2抑制高糖诱导EPCs衰老;外源性给予ADMA(0,0.3,0.6,1μtmol/L)探讨ADMA诱导EPCs衰老作用;运用SIRT1激动剂白藜芦醇探讨SIRT1调节高糖诱导细胞衰老作用机制。
　　 梯度离心加粘附分离正常人外周血EPCs。细胞处理48 h后,β-半乳糖苷酶活性评价细胞衰老。其他指标的检测为细胞处理24 h时,Real-time PCR与Western Blot检测DDAH2、SIRT1 mRNA与蛋白表达,HPLC检测细胞上清ADMA水平,Griess法检测上清NO水平。
　　 结果：
　　 2型糖尿病患者外周血EPCs衰老率显著升高,DDAH2与SIRT1mRNA表达下调,同时伴随ADMA水平升高。
　　 结论：
　　 DDAH2/ADMA参与了高糖诱导的EPCs衰老,其作用涉及SIRT1途径。
　　 第三章、白藜芦醇衍生物改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及抑制内皮祖细胞衰老
　　 背景：
　　 白藜芦醇(resveratrol,RSV)是一种多酚类的SIRT1天然激动剂。SIRT1参与糖代谢和胰岛素分泌的调节。糖尿病大鼠实验证明,RSV能上调VEGF与eNOS表达,抑制氧化应激反应,提高糖尿病大鼠骨髓细胞血管形成能力。细胞实验证明,RSV促进人外周血EPCs增殖、迁移以及血管新生。此外,RSV也能抑制TNF-α所致EPCs损伤。
　　 (E)-3,5,4'-三甲氧基-1,2-二苯乙烯((E)-3,5,4'-trimethoxystilbene,BTM-0512)是RSV的甲基化衍生物,其口服吸收率与半衰期均优于RSV。
　　 依据RSV对血管内皮和EPC保护作用以及SIRT1-DDAH2/ADMA对EPCs功能及衰老的调节作用,本实验在高脂饮食加单次腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱发的2型糖尿病大鼠模型与培养大鼠骨髓EPCs细胞,探讨RSV衍生物BTM-0512能否改善胰岛素抵抗,以及对EPCs衰老的影响及机制。
　　 方法：
　　 动物实验:高脂饮食加单次腹腔注射STZ(35 mg/kg)建立2型糖尿病大鼠模型。实验分为正常对照组、模型组、BTM-0512低剂量组(10 mg/kg)和BTM-0512高剂量组(40 mg/kg)。大鼠连续灌胃3周。
　　 取大鼠全血,分离血浆检测大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(Hb1AC)、葡萄糖耐量(OGTT)、HOME.IR、胰岛素敏感指数(IAI)、胰岛素分泌指数(IS)以及ADMA浓度。切取胸主动脉观测内皮依赖性舒张反应,免疫组化检测血管内皮DDAH2、SIRT1蛋白表达。采用梯度离心加选择性粘附分离大鼠骨髓EPCs细胞,β-半乳糖苷酶活性评价细胞衰老程度,Real-time PCR检测EPCs DDAH2、SIRT1mRNA表达,tube小管形成实验检测EPCs血管形成能力,transwell小室评价EPCs迁移能力,纤维连接蛋白粘附法评价EPCs粘附能力。
　　 细胞实验:高糖处理EPCs,探讨BTM-0512(0.3,1,3μM)抑制高糖诱导EPCs衰老及可能机制,给予SIRT1特异性阻断剂splitomicin(50μM)探讨SIRT1在BTM-0512对EPCs保护中作用。Β-半乳糖苷酶活性评价细胞衰老,Real-time PCR检测DDAH2、SIRT1 mRNA表达,Western Blot检测DDAH2蛋白表达;HPLC检测细胞上清ADMA水平。
　　 结果：
　　 BTM-0512能剂量依赖性降低2型糖尿病大鼠FBG和Hb1AC,改善HOME.IR和IAI,但对OGTT与IS没有影响。
　　 在培养EPCs,BTM-0512能剂量依赖性抑制高糖诱导细胞衰老,上调细胞DDAH2、SIRT1 mRNA表达并降低培养上清中ADMA浓度。
　　 结论：
　　 1.BTM-0512可降低2型糖尿病大鼠血糖,改善IR,并能改善血管舒张功能。
　　 2.BTM-0512能减轻高糖所致EPCs衰老,其机制涉及SIRT1-DDAH2/ADMA途径。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

第一章 二甲基精氨酸-二甲胺水解酶参与内皮祖细胞分化及功能调控 l

1．前言

2．材料方法

3．结果

4．附图

5．讨论

6．结论

第二章 二甲基精氨酸-二甲胺水解酶／非对称二甲基精氨酸在2型糖尿病内皮祖细胞衰老中的作用及机制

1．前言

2．材料方法

3．结果

4．附图表

5．讨论

6．结论

第三章 白藜芦醇衍生物改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及抑制内皮祖细胞衰老

1．前言

2．材料方法

3．结果

4．附图表

5．讨论

6．结论

参考文献

综述 SIRT1生物学活性研究进展

致谢

攻读博士学位期间主要研究成果