二甲基精氨酸二甲胺水解酶测定方法及其诊断试剂

摘要

本发明是关于一种二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力的酶学循环测定方法，及其诊断试剂。在设计的产品检测方法中：组织样本中的二甲基精氨酸二甲胺水解酶催化非对称二甲基精氨酸水解，生成瓜氨酸；在这一新的设计方法中，使瓜氨酸在瓜氨酸水解酶(EC 3.5.1.20)和鸟氨酸氨甲酰转移酶(EC 2.1.3.3)及其底物组成的酶循环反应系统不断循环反应，从而大大地提高了反应灵敏度，瓜氨酸生成量与样本中二甲基精氨酸二甲胺水解酶的活力成正比，通过测定循环酶反应体系中氨的生成速率，就可以达到测定样本中二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力的目的。本发明试剂可以是干粉试剂，也可以是液体试剂；可以是单剂试剂，双剂试剂或多剂试剂。

说明书

技术领域：

本发明涉及二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase EC3.5.3.18，DDAH)活力的酶学循环测定方法及其诊断试剂，属于医学检验测定技术领域。

背景技术：

非对称二甲基精氨酸是一种甲基化精氨酸，是内源性一氧化氮合酶(Nitric oxide sythase，NOS)抑制剂，可竞争性抑制一氧化氮(Nitric oxide，NO)的合成。它是细胞内蛋白质在精氨酸甲基转移酶作用下发生甲基化，再经水解反应生成的非对称二甲基精氨酸。二甲基精氨酸二甲胺水解酶通过调节体内非对称二甲基精氨酸的水平而影响NOS的活性，进而调节体内NO的生成。DDAH活性与多种心血管疾病之间存在密切关系，被认为是新的心血管疾病相关蛋白和药物防治靶点。

DDAH是胞内酶，有DDAH1和DDAH2两个亚型，与胚胎组织比较，出生后组织中DDAH2表达显著增加，而DDAH1表达基本无变化。这两种亚型在体内分布存在差异，其中DDAH1多存在于主要表达神经型NOS的组织，如大脑和肾脏等；而DDAH2则多存在于以内皮型NOS表达为主的组织，如心脏、血管和肾脏等。

临床应用中对二甲基精氨酸二甲胺水解酶的测定方法主要包括：高压液相色谱法、酶联免疫法等。上述方法的共同特点是需要特别的测定仪器、操作复杂，试验耗时较长，不能应用于临床大流量的自动化分析，并且价格昂贵。

Y-L Tain和C Baylis在Kidney Int.2007 October；72(7)：886-889中报道了一种测定大鼠肾脏组织样本中DDAH的改良方法，该方法采用手工法测定生成的L-瓜氨酸，灵敏度低，不能自动化。

由于DDAH在组织样本中的含量很低，常规临床酶学的测定方法无法达到所需的测定灵敏度，限制了常规方法的采用。在酶学方法测定DDAH技术方面，虽然近年来酶学检测的信号增量技术不断发展，但至今未见有关酶循环法测定DDAH活力的方法学报道；也未见DDAH全自动诊断试剂的报道和应用。

本发明公开了一种新的测定组织样本中DDAH的酶循环方法，该方法不受样本中干扰物质的干扰，具有优良的反应灵敏度。首次提出并建立了采用酶学循环方法测定组织样本中DDAH方法学新原理及其应用试剂。该试剂可应用于目前各类广泛使用的临床自动分析仪，从而达到快速、大规模测定样本的要求。

发明内容：

本发明提供了一种采用循环增量技术的酶学测定方法及其试剂，测定组织样本中DDAH的活力。其设计原理是：样本中的DDAH催化非对称二甲基精氨酸水解为二甲胺和L-瓜氨酸(L-Citrulline)，产物L-瓜氨酸在瓜氨酸水解酶(Citrullinase EC 3.5.1.20)的作用下，水解为L-鸟氨酸(L-Ornithine)、二氧化碳和氨；生成的L-鸟氨酸与试剂中的氨基甲酰磷酸盐在鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase EC 2.1.3.3)的作用下，再生成L-瓜氨酸和磷酸盐。在该酶循环反应系统中，L-瓜氨酸的生成量与样本中DDAH的活力成正比，通过测定酶循环反应体系中氨的生成速率，就可以达到测定样本中DDAH活力的目的。

临床应用中酶法测定氨浓度的方法很多，最常见的是谷氨酸脱氢酶反应方法。氨与a-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的作用下，产生L-谷氨酸，同时辅酶NADH或NADPH被氧化为NAD⁺或NADP⁺，反应系统在340nm处的吸光度值下降。可通过测定该吸光度的下降值计算出氨的浓度，从而得出被测酶的活力。

由于本发明设计的酶循环方法中的L-瓜氨酸反复循环参与反应，不断产生氨，故大大提高了测定的灵敏度。

本发明关于DDAH活力测定的酶循环法测定方法学原理如下：

非对称二甲基精氨酸+水二甲基精氨酸二甲胺水解酶L-瓜氨酸+二甲胺

L-瓜氨酸+水瓜氨酸水解酶L-鸟氨酸+二氧化碳+氨

L-鸟氨酸+氨基甲酰磷酸盐鸟氨酸氨甲酰转移酶L-瓜氨酸+磷酸盐

本发明首次创建了由瓜氨酸水解酶(Citrullinase EC 3.5.1.20)和鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase EC 2.1.3.3)组成的酶循环反应测定方法，并应用于样本中DDAH酶活力的测定。基于酶法循环增量测定的特点，循环反应系统的酶使用量不要求很高，最终反应浓度一般在0.1～500ku/L之间，最好在0.2～50ku/L之间，酶的用量与酶的催化活力有关。当然，增加酶的用量并不影响本发明方法的应用，但会增加试剂的制造成本。优化酶和底物应用量可以促进循环反应向理想的方向进行，在循环机制中非对称二甲基精氨酸、氨基甲酰磷酸盐的用量应过量。

本发明同时公开了基于上述方法的体外诊断测定试剂，采用本方法可以大大提高测定灵敏度，使其第一次能够像自动化酶学诊断试剂一样应用于各类半自动或全自动生化分析仪，进行快速、大流量的样本检测。

利用本发明的酶循环方法，可以按照普通酶学诊断技术制备出各种单一剂型、双液体试剂剂型或多液体试剂剂型的DDAH诊断测定试剂。

在本发明的一个实施例中，根据上述反应原理，采用谷氨酸脱氢酶方法测定氨生成的速率：

氨+a-酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶L-谷氨酸+氧化型辅酶

通过监测还原型辅酶特定波长处吸光度变化的变化，检测酶循环反应系统中氨的生成速率，可以计算出样本中DDAH的活力。在临床诊断酶学测定试剂中，常用的辅酶或其类似物包括：还原型辅酶I(NADH)、还原型辅酶II(NADPH)、硫代还原型辅酶I(thio-NADH)、硫代还原型辅酶II(thio-NADPH)等。其中NADH或NADPH其特定检测吸光度在340nm，thio-NADH或thio-NADPH其特定检测吸光度在398nm处，在各种分析仪器上在405nm附近进行检测。

也可进一步采用酶循环法测氨的方法，在此不再列举，本专业的技术人员可以根据上述原理，设计出多种酶循环测氨的方法和试剂，但并不脱离本发明的应用范围。

采用本发明酶循环机制配制的DDAH测定试剂中包含缓冲液，如：磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙基磺酸)(HEPES)缓冲液等；非对称二甲基精氨酸采用的是非对称二甲基精氨酸二盐酸盐，也可以是其它盐结晶形式；稳定剂，包括但并不局限于以下一种或多种化合物：甘露糖醇、甘油、聚乙二醇、EDTA、金属离子(如钾离子、钠离子、锌离子)、氯离子、牛血清白蛋、表面活性剂及至少一种防腐剂等。

上述两种方法学试剂在应用中的测定方法，与本专业中常规的应用方法相同，如：可以采用速率法或两点法，通过参照校准品或绘制标准浓度曲线等，计算出被测物的含量，在此不再赘述。本专业技术人员根据本发明的原理和方法配制出各种类似的测定试剂，但并不脱离出本发明的原理和应用范围。

具体实施方式：

实施例1：采用本发明建立的酶循环反应机制，直接测定试剂系统产生的还原型辅酶I。

  试剂组份  每升用量  常用每升用量范围  缓冲液  100mmol  10～300mmol  非对称二甲基精氨酸二盐酸盐  0.5g  0.01～50g  瓜氨酸水解酶  25ku  0.1～500ku  鸟氨酸氨甲酰转移酶  15ku  0.1～500ku  氨基甲酰磷酸盐  5mmol  0.01～120mmol  谷氨酸脱氢酶  1ku  0.1～50ku  还原型辅酶I  0.28mmol  0.1～5mmol  a-酮戊二酸  7mmol  1～100mmol  稳定剂  5％体积比  0.1～100％体积比

实施例2：也可将上述实施例1中的试剂配制成双试剂，各试剂组分在试剂1或试剂2中的位置不限，可以是干粉试剂，使用前加水溶解使用，也可以是液体试剂，直接或混合使用：

  试剂1  缓冲液  100mmol/L  还原型辅酶I  0.35mmol/L  瓜氨酸水解酶  25ku/L

  鸟氨酸氨甲酰转移酶  15ku/L  稳定剂  5％体积比

  试剂2  缓冲液  100mmol/L  非对称二甲基精氨酸二盐酸盐  0.5g  谷氨酸脱氢酶  5ku/L  a-酮戊二酸  28mmol/L  氨基甲酰磷酸盐  7mmol/L  稳定剂  5％体积比

实施例3：也可将上述实施例1中的试剂配制成三试剂，各试剂组分在试剂1、试剂2或试剂3中的位置不限，各组分可以是干粉试剂，使用前加水溶解使用，也可以是液体试剂，直接或混合使用：

  试剂1  缓冲液  100mmol/L  还原型辅酶I  0.32mmol/L  谷氨酸脱氢酶  3ku/L  a-酮戊二酸  28mmol/L  稳定剂  5％体积比

  试剂2  缓冲液  100mmol/L  氨基甲酰磷酸盐  15mmol/L  稳定剂  5％体积比

  试剂3  缓冲液  100mmol/L  非对称二甲基精氨酸二盐酸盐  1g  瓜氨酸水解酶  15ku/L  鸟氨酸氨甲酰转移酶  15ku/L  稳定剂  5％体积比

上述实施例1～实施例3配方中稳定剂用摩尔浓度表示在0.1～3000mmol/L。测定样本时，采用固定时间法，试剂与样本的比例没有固定要求，但同一测定批次内应一致。如试剂∶样本为300∶30，温度37℃，测定波长340nm，试剂加样本或校准品后在测定温度孵育120～300秒，除去样本中的白蛋白干扰，然后开始测定，延迟时间0～120秒，可用于排除样本中其它副反应，测定时间可根据仪器的灵敏度进行调节，读数在测定时间内选择至少2个有效点。在一些自动化生化分析仪上，液体单一试剂剂型、液体双试剂剂型或液体三试剂剂型可直接应用。

实施例4：采用本发明建立的酶循环反应机制，直接测定试剂系统产生的还原型辅酶II。

  试剂组份  每升用量  常用每升用量范围  缓冲液  100mmol  10～300mmol  非对称二甲基精氨酸二盐酸盐  0.5g  0.01～50g  瓜氨酸水解酶  25ku  0.1～500ku  鸟氨酸氨甲酰转移酶  15ku  0.1～500ku  氨基甲酰磷酸盐  5mmol  0.01～120mmol  谷氨酸脱氢酶  1ku  0.1～50ku  还原型辅酶II  0.28mmol  0.1～5mmol  a-酮戊二酸  7mmol  1～100mmol  稳定剂  5％体积比  0.1～100％体积比

实施例5：也可将上述实施例4中的试剂配制成双试剂，各试剂组分在试剂1或试剂2中的位置不限，可以是干粉试剂，使用前加水溶解使用，也可以是液体试剂，直接或混合使用：

  试剂1  缓冲液  100mmol/L  还原型辅酶II  0.35mmol/L  瓜氨酸水解酶  25ku/L  鸟氨酸氨甲酰转移酶  15ku/L  稳定剂  5％体积比

  试剂2  缓冲液  100mmol/L  非对称二甲基精氨酸二盐酸盐  0.5g  谷氨酸脱氢酶  5ku/L  a-酮戊二酸  28mmol/L  氨基甲酰磷酸盐  7mmol/L  稳定剂  5％体积比

实施例6：也可将上述实施例4中的试剂配制成三试剂，各试剂组分在试剂1、试剂2或试剂3中的位置不限，各组分可以是干粉试剂，使用前加水溶解使用，也可以是液体试剂，直接或混合使用：

  试剂1  缓冲液  100mmol/L  还原型辅酶II  0.32mmol/L  谷氨酸脱氢酶  3ku/L  a-酮戊二酸  28mmol/L  稳定剂  5％体积比

  试剂2  缓冲液  100mmol/L  氨基甲酰磷酸盐  15mmol/L  稳定剂  5％体积比

  试剂3  缓冲液  100mmol/L  非对称二甲基精氨酸二盐酸盐  1g  瓜氨酸水解酶  15ku/L  鸟氨酸氨甲酰转移酶  15ku/L  稳定剂  5％体积比

上述实施例4～实施例6配方中稳定剂用摩尔浓度表示在0.1～3000mmol/L。测定样本时，采用固定时间法或速率法，试剂与样本的比例没有固定要求，但同一测定批次内应一致。如试剂∶样本为300∶30，温度37℃，测定波长340nm，试剂加样本或校准品后在测定温度孵育120～300秒，除去样本中的白蛋白干扰，然后开始测定，延迟时间0～120秒，可用于排除样本中其它副反应，测定时间可根据仪器的灵敏度进行调节，读数在测定时间内选择至少2个有效点。在一些自动化生化分析仪上，液体单一试剂剂型、液体双试剂剂型或液体三试剂剂型可直接应用。

实施例7：采用本发明建立的酶循环反应机制，直接测定试剂系统产生的还原型硫代辅酶I。

  试剂组份  每升用量  常用每升用量范围  缓冲液  100mM  10～300mM  非对称二甲基精氨酸二盐酸盐  0.5g  0.01～50g  瓜氨酸水解酶  25ku  0.1～500ku  鸟氨酸氨甲酰转移酶  15ku  0.1～500ku  氨基甲酰磷酸盐  5mmol  0.01～120mmol

  谷氨酸脱氢酶  1ku  0.1～50ku  还原型硫代辅酶I  0.26mmol  0.1～5mmol  a-酮戊二酸  7mmol  1～100mmol  稳定剂  5％体积比  0.1～100％体积比

实施例8：也可将上述实施例7中的试剂配制成双试剂，各试剂组分在试剂1或试剂2中的位置不限，可以是干粉试剂，使用前加水溶解使用，也可以是液体试剂，直接或混合使用：

  试剂1  缓冲液  100mmol/L  还原型硫代辅酶I  0.32mmol/L  瓜氨酸水解酶  25ku/L  鸟氨酸氨甲酰转移酶  15ku/L  稳定剂  5％体积比

  试剂2  缓冲液  100mmol/L  非对称二甲基精氨酸二盐酸盐  0.5g  谷氨酸脱氢酶  5ku/L  a-酮戊二酸  28mmol/L  氨基甲酰磷酸盐  7mmol/L  稳定剂  5％体积比

实施例9：也可将上述实施例7中的试剂配制成三试剂，各试剂组分在试剂1、试剂2或试剂3中的位置不限，各组分可以是干粉试剂，使用前加水溶解使用，也可以是液体试剂，直接或混合使用：

 试剂1

 缓冲液  100mmol/L 还原型硫代辅酶I  0.32mmol/L 谷氨酸脱氢酶  3ku/L a-酮戊二酸  28mmol/L 稳定剂  5％体积比

  试剂2  缓冲液  100mmol/L  氨基甲酰磷酸盐  15mmol/L  稳定剂  5％体积比

  试剂3  缓冲液  100mmol/L  非对称二甲基精氨酸二盐酸盐  1g  瓜氨酸水解酶  15ku/L  鸟氨酸氨甲酰转移酶  15ku/L  稳定剂  5％体积比

上述实施例7～实施例9配方中稳定剂用摩尔浓度表示在0.1～3000mmol/L。测定样本时，采用固定时间法或速率法，试剂与样本的比例没有固定要求，但同一测定批次内应一致。如试剂∶样本为300∶30，温度37℃，测定波长405nm，试剂加样本或校准品后在测定温度孵育120～300秒，除去样本中的白蛋白干扰，然后开始测定，延迟时间0～120秒，可用于排除样本中其它副反应，测定时间可根据仪器的灵敏度进行调节，读数在测定时间内选择至少2个有效点。在一些自动化生化分析仪上，液体单一试剂剂型、液体双试剂剂型或液体三试剂剂型可直接应用。

上述实施例试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理及其应用，本发明绝不局限于上述举例的应用范围；此外，在本发明相关领域中的专业技术人员，可以根据本发明的原理和方法配制出与之类似的各种测定试剂，但并不脱离出本发明的原理和应用范围。