CKS1B基因促进多发性骨髓瘤细胞增殖与病程恶化的SKP2/P27非依赖性机制研究

摘要

本文为了进一步阐述CKS1B影响多发性骨髓瘤细胞生存和增殖的分子机制，以及研究CKS1B在多发性骨髓瘤疾病预后中所起的作用，进行了如下研究，并取得了相应的结果：
　　 1.CKS1B在多发性骨髓瘤病人中表达水平增高，并随病情进展而升高
　　 本文用骨髓瘤病人骨髓中肿瘤细胞mRNA做基因芯片分析，比较了51个病人从刚确诊到复发后的CKS1B表达水平的变化，Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，在以初诊-复发配对比较的51位病人中，和那些从初诊断到复发CKS1B表达水平没有明显增高的病人相比，增高1.5倍以上的36位病人复发后4年的生存率显著性的低。证实了CKS1B在多发性骨髓瘤的诊断阶段是个诊断指标，并且也是个预示病人预后不良的指标。
　　 2.CKS1B基因过表达表达促进骨髓瘤细胞的增殖并提高细胞的耐药性
　　 利用lentenvirus病毒系统转染骨髓瘤细胞，建立了CKS1B过表达的细胞系。细胞分别在含1％、5％、10％胎牛血清的培养基中培养7天，与转染空白载体的对照组细胞相比，CKS1B高表达的骨髓瘤细胞表现出更高的增殖率,实验证明，CKS1B能促进骨髓瘤细胞的增殖。证明了CKS1B高表达诱发了骨髓瘤细胞对多种抗肿瘤药物耐药。
　　 3.CKS1B基因通过SKP2-p27依赖和非依赖性途径影响骨髓瘤细胞生长和生存
　　 本课题组为了研究CKS1B基因促进骨髓瘤生长和疾病进程的机制，在骨髓瘤细胞中，CKS1B基因敲除引起SKP2表达降低和p27表达上调，并且导致强烈的细胞凋亡和生长抑制。试验结果提示CKS1B是通过SKP2-p27依赖性和非依赖性途径影响骨髓瘤细胞生长和生存，并且SKP2-p27非依赖性途径可能更重要一些。
　　 4.临床分析和信息学分析提示CKS1B基因可能主要通过SKP2-p27非依赖性途径影响骨髓瘤细胞生长和疾病进程
　　 为了进一步证实CKS1B影响骨髓瘤细胞生长的机制中的确存在SKP2-p27非依赖性途径，在351个接受TT2治疗方案的多发性骨髓瘤新诊断病人中，利用Kaplan-Meier生存曲线分别比较CKS1B高/低表达、SKP2高/低表达以及p27低/高表达病人的生存率。结果显示，CKS1B高表达的病人生存期明显短于低表达的病人，P<0.001；而SKP2高、低表达的病人生存时间没有明显的差异；p27低、高表达的病人生存时间也没有明显的差异。
　　 这个临床证据表明，CKS1B、SKP2和p27对多发性骨髓瘤疾病进程的影响不同，只有CKS1B的表达显著影响疾病的进行和恶化。
　　 5.骨髓瘤细胞中CKS1B非依赖SKP2-P27激活STAT3，MEK/ERK和BCL2信号途径
　　 根据信息学分析的提示，在CKS1B基因敲除骨髓瘤细胞系OCI-MY5中，通过Western-Blot筛选了MAPK，NF-kB，TP53，P13K/AKT,STAT3等重要细胞信号途径的主要信号分子。检测到在骨髓瘤细胞OCI-MY5中，CKS1B基因敲除后引起下列信号分子蛋白表达下调。
　　 为了进一步明确STAT3，MEK/ERK，BCL2是CKS1B的下游调控分子，通过Western-Blot检测了CKS1B cDNA转染细胞系OCI-MY5和XG1中以上分子的表达。结果显示，在CKS1B外源性高表达的细胞中，p-MEK1/2，p-ERK1/2，p-STAT3，MCL-1，和P—BCL2表达上调。这些结果证实，STAT3，MEK/ERK，BCL2是CKS1B的下游调控分子，CKS1B可能通过它们影响骨髓瘤细胞生长和生存。
　　 6.CKS1B通过激活STAT3/MCL1信号通路促进骨髓瘤细胞增殖和生存
　　 胰岛素样生长因子1是得到公认的骨髓瘤细胞生长因子，能激活STAT3信号途径，促进STAT3磷酸化。为了研究STAT3在CKS1B促进骨髓瘤细胞增殖和生存中所发挥的作用，用含IGF-1的培养基培养CKS1B基因敲除的KMS28PE,OCI-MY5，和XG1细胞72小时。Western-Blot证实，在IGF-1培养的细胞p-STAT3，MCL1表达增高。CKS1B基因敲除的细胞，通过IGF-1上调p-STAT3的表达后，细胞凋亡和抑制生长被部分阻止。以上结果证明了CKS1B通过激活STAT3/MCL1影响骨髓瘤细胞的增殖和生存。
　　 抗生素肖夫齐特，已被证明是JAK/STAT信号通路的特异性抑制剂，能够在骨髓里细胞中抑制STAT3的磷酸化。为了证明JAK/STAT3是CKS1B下游信号通路并观察靶向阻断STAT3通路对CKS1B高表达骨髓瘤细胞生长的影响，将CKS1B转染的骨髓瘤细胞OCI-MY5和XG1，在含10nM Nif培养基中培养48小时。WB验证，Nif处理后的细胞p-STAT3蛋白水平下降。与EV细胞相比，CKS1B转染的OCI-MY5和XG1细胞有更高的细胞死亡率。CKS1B高表达的细胞对STAT3特异性抑制剂Nifi诱发的细胞凋亡更敏感。
　　 7.CKS1B通过激活MEK/ERK信号通路促进骨髓瘤细胞增殖和生存
　　 在CKS1B基因敲除后的细胞中，通过LentiVirus转染MEK1-cDNA，使MEK1基因特异性高表达。WB验证MEK1转染细胞后p-MEK1/2和p-ERK1/2表达大幅度增加，并且磷酸化p-BCL2被激活。说明转染MEK1导致的MEK/ERK通路的激活，抵消了CKS1B基因敲除导致的bcl2下调，从而证明BCL2是MEK/ERK下游调控分子。MEK1基因高表达，同时CKS1B基因敲除的骨髓瘤细胞KMS28PE,OCI-MY5，和XG1，虽然仍存在细胞凋亡和生长受抑制，但是与单纯CKS1B基因敲除的细胞相比较，细胞死亡率显著性降低，存活细胞总数也显著性增多。由此证明，MEK/ERK的外源性高表达和磷酸化激活，部分抵消了CKS1B基因敲除引起的骨髓瘤细胞死亡和生长抑制。以上研究证明，CKS1B通过激活MEKK/ERK通路，以及其下游的BCL2通路，影响骨髓瘤细胞的增殖和生存.
　　 8.BCL2信号通路的激活与CKS1B介导的骨髓瘤细胞增殖和存活相关
　　 实验结果已经提示BCL2是CKS1B和MEK/ERK信号通路的下游调控分子，为了确证BCL2在CKS1B促进骨髓瘤细胞生长的机制所起的作用，在CKS1B基因敲除后细胞中，通过LentiVirus转染BCL2-cDNA，使BCL2过表达。Western-Blot验证p-BCL2磷酸化被激活。BCL2过表达，同时CKS1B基因敲除的骨髓瘤细胞，虽然仍存在细胞凋亡和生长抑制，但是与单纯CKS1B基因敲除的细胞相比较，细胞死亡率显著性降低，存活细胞总数也显著性增多。由此证明，BCL2的外源性高表达和BCL2磷酸化，部分抵消了CKS1B基因敲除引起的骨髓瘤细胞死亡和生长抑制。以上研究证明了，BCL2在CKS1B促进骨髓瘤细胞的增殖和生存的过程中发挥重要作用。
　　 9.对CKS1B高表达的细胞联合应用STAT3、MEK和BCL2抑制剂，存在协同作用
　　 由于CKS1B通过激活MEK/ERK和STAT3信号通路促进骨髓瘤细胞生长，靶向于这2条通路的药物联合应用可能会对骨髓瘤细胞造成更强有力的杀伤效果。
　　 使用STAT3抑制剂联合MEK1抑制剂，或者联合BCL2抑制剂，处理CKS1B高表达的骨髓瘤细胞OCI—MY5Y。结果显示联合应用这2条信号通路抑制剂，都对CKS1B高表达细胞和空白对照细胞造成强烈的细胞毒作用，而CKS1B过表达细胞的死亡率显著更高，效果强于单独用药。我们又在CKS1B高表达的细胞XG1中重复了这一实验，得到相同的结果。这一实验进一步证实了，与CKS1B表达低的骨髓瘤细胞相比，对CKS1B高表达的骨髓瘤细胞应用STAT3和MEK/ERK抑制剂治疗方案，疗效会更好。
　　 10.FOXM1在骨髓瘤细胞中抑制CKS1B的表达并上调P27，同时也被P27正反馈调控
　　 CKS1B在多发性骨髓瘤病人中高表达已经被多个研究者所证实，而CKS1B在骨髓瘤细胞中增高的机制，除了与染色体1q21区域扩增外相关，并无更多的研究。
　　 有文献报道在人骨肉瘤中，转录因子FOXM1能上调CKS1的表达，临床观察和实验室资料也发现FOXM1高表达的MM病人预后差。为了研究FOXM1与CKS1B之间的关系，我们建立了FOXM1高表达骨髓瘤细胞系，WB验证FOXM1过表达引起CKS1B蛋白水平上调，和P27蛋白水平下调；而WB也显示，CKS1B基因敲除后并没有引起FOXM1表达水平的变化，而P27过表达则导致FOXM1表达增加。因此FOXM1是CKS1B的上游调控基因，能抑制CKS1B从而减少P27的降解，但是当P27的表达增高时，反过来又促进了FOXM1的表达，FOXM1-CKS1B-P27之间存在相互作用的调控关系。
　　 小结：本课题的研究，探讨了CKS1B在骨髓瘤中过表达的机制，证实了骨髓瘤细胞中CKS1B接受转录因子FOXM1的正向调控；证明了CKS1B基因促进骨髓瘤细胞生长存活和对多种抗肿瘤药物耐药疾病；阐述了CKS1B促进骨髓瘤细胞生长的SKP2-p27非依赖性机制，证实CKS1B通过激活STAT3,MEK/ERK/BCL2信号通路促进骨髓瘤细胞生长和存活，并且证实CKS1B过表达细胞对靶向阻断STAT3,MEK/ERK/BCL2通路的药物特别敏感，为临床治疗难治型特别是CKS1B高表达型多发性骨髓瘤提供了实验室证据和思路。