有机磷酸酯杀虫剂促进动脉粥样硬化形成及机制探讨

摘要

第一章、毒死蜱对高脂饮食致免AS形成的影响及相关机制研究
　　 目的:
　　 探讨毒死蜱对高脂饮食致动脉粥样硬化形成的影响及相关机制。
　　 方法:
　　 1.32只健康雄性新西兰兔随机分为如下四组(n=8):对照组、毒死蜱组、高脂饮食组、高脂饮食+毒死蜱组。高脂饮食配方为通用配方,毒死蜱的剂量为(20 mg/kg/d,毒死蜱兔的口服LD50为1000-2000 mg/kg),连续观察6个月。
　　 2.动物处死前从耳缘静脉取血并分离出血清储存,用于检测血脂水平和胆碱酯酶(AChE)、对氧磷酶1(PON1)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及丙二醛(MDA)的含量,及相关肝、肾功能指标。
　　 3.收集并培养腹腔巨噬细胞,测定其胆固醇流出率。
　　 4.切取一段胸主动脉采用离体血管环灌流法检测血管舒缩功能。
　　 5.采用苏丹Ⅳ染色法观察胸主动脉粥样硬化斑块,计算斑块与血管内皮表面积的百分比。颈总动脉、主动脉弓作石蜡切片,用以观察血管的形态学变化。
　　 6.采用实时定量PCR和蛋白印迹法分别检测肝、血管组织和腹腔巨噬细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达以及肝脏PON1的表达。
　　 结果:
　　 1.高脂饮食6个月,其血浆总胆固醇和脂蛋白水平明显升高,SOD活性降低,而MDA水平升高,其肝脏、主动脉和腹腔巨噬细胞中ABCA1的表达升高,腹腔巨噬细胞中胆固醇流出增加,肝脏中PON1的表达降低,与对照组相比,均有显著性差异;其主动脉和颈总动脉有明显的动脉粥样硬化斑块形成。但血清AChE有轻度升高,但无显著性差异。
　　 2.毒死蜱组兔血清AChE和PON1、和SOD活性和HDL-C水平降低,MDA水平升高,与对照组比较有显著性差异;肝肾功能指标与对照组比,无显著性差异。主动脉和腹腔巨噬细胞ABCA1的表达、肝脏PON1的表达均有降低,腹腔巨噬细胞中胆固醇流出减少,与对照组比较有显著性差异。
　　 3.高脂饮食+毒死蜱组PON1、和SOD活性和HDL-C水平降低,MDA水平升高,主动脉和腹腔巨噬细胞ABCA1的表达、肝脏PON1的表达均有降低,腹腔巨噬细胞中胆固醇流出减少,与单高脂饮食组或毒死蜱组相比,上述指标的改变更明显,统计学处理有显著性差异。主动脉和颈总动脉粥样硬化斑块更加明显。但血清AChE无明显改变。
　　 结论:
　　 亚毒性剂量的毒死蜱可加快高脂饮食致动脉粥样硬化形成,加重血清中总胆固醇、脂蛋白、及其它生化指标的改变,其机制可能与毒死蜱消耗有抗氧化作用的PON1和降低其活性,从而间接或直接触发氧化应激,损伤内皮功能,降低体内ABCA1的表达,继而减少胆固醇流出有关。
　　 第二章、对氧磷促鼠源巨噬细胞性泡沫细胞形成及机制探讨
　　 目的:
　　 探讨对氧磷对Ox-LDL诱导的鼠源巨噬细胞性泡沫细胞形成及相关机制
　　 方法:
　　 1.将RAW264.7巨噬细胞,分为下例5组:(1)对照组,(2)Ox-LDL泡沫细胞模型组,(3-5)组分别为Ox-LDL+对氧磷(1、10和100μmol/1)组。各组细胞置5％CO2培养箱,37℃,常规培养72 h。
　　 2.油红染色进行形态学观察,高效液相色谱法测定细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)水平,及胆固醇流出率。
　　 3.采用实时定量PCR和蛋白印迹法分别检测巨噬细胞中CD36、ABCA1、和酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)的表达。
　　 结果:
　　 1.Ox-LDL处理48 h后,与正常巨噬细胞相比,油红O染色阳性细胞显著增加,细胞体积明显增大,形态多呈圆形或不规则形;对氧磷(10,100μ mol/l)组细胞油红O染色阳性细胞比Ox-LDL模型组形态学改变更明显,细胞体积明显增大,而对氧磷(1μ mol/l)组细胞与模型组相比没有显著性差异。
　　 2.泡沫细胞模型组细胞内TC、FC、CE水平显著高于对照组,且CE/TC有显著性差异;对氧磷(10,100μmol/l)组细胞内TC、FC、CE水平及CE/TC均有显著性增加,与泡沫细胞模型组相比,有显著性差异,对氧磷(1μmol/l)组TC、FC、CE与泡沫细胞模型组差异无显著性。
　　 3.Ox-LDL泡沫细胞模型组细胞胆固醇流出率显著性增加,与对照组相比,有显著性差异;对氧磷(10和100μmol/l)组细胞胆固醇流出率显著性降低,与泡沫细胞模型组相比,有显著性差异;对氧磷(1μmol/l)处理组与泡沫细胞模型组相之间无显著性差异。
　　 4.Ox-LDL刺激的泡沫细胞组与对照组比CD36 mRNA表达显著增加,Ox-LDL刺激的泡沫细胞加对氧磷(10和100μmol/l)组与泡沫细胞组相比CD36 mRNA表达显著增加。对氧磷(1μmol/l)处理组与泡沫细胞模型组相比没有显著性差异。
　　 5.泡沫细胞模型组ABCA1表达较对照组显著增加;与模型组相比,对氧磷(10和100μmol/1)显著地下调了泡沫细胞中ABCA1的表达,而对氧磷(1μmol/l)没有影响泡沫细胞中ABCA1的表达。
　　 6.泡沫细胞模型组ACAT1mRNA表达较对照组显著增加;与模型组相比,对氧磷(10和100μmol/l)组显著地增加了泡沫细胞中ACAT1的表达,而对氧磷(1μmol/l)处理组没有明显增加泡沫细胞的ACAT1mRNA表达。
　　 结论:
　　 对氧磷能加速Ox-LDL诱导的鼠源巨噬细胞性泡沫细胞形成。其机制可能与对氧磷上调泡沫细胞中CD36和ACAT1表达而降低ABCA1的表达有关。
　　 第三章、对氧磷通过干预cAMP信号通路下调鼠源巨噬细胞性泡沫细胞ABCA1表达和胆固醇流出
　　 目的:
　　 探讨对氧磷下调鼠源巨噬细胞性泡沫细胞ABCA1表达和胆固醇流出的机制
　　 方法:
　　 1.将Ox-LDL刺激形成的鼠源巨噬细胞性泡沫细胞分为以下组:(1)对照组,(2)对氧磷处理组:对氧磷(1,10和100μmol/l)孵育泡沫细胞24 h;对氧磷(100μmol/1)孵育泡沫细胞(6,12,24)h。
　　 2.高效液相色谱法测定测定细胞内TC及FC水平,计算CE,测定胆固醇流出率。
　　 3.采用ELISA法检测泡沫细胞内cAMP水平、腺苷酸环化酶和磷酸二脂酶的活性。
　　 4.采用实时定量PCR和蛋白印迹分别检测泡沫细胞中ABCA1的mRNA和蛋白水平的表达。
　　 结果:
　　 1.对氧磷以时间和剂量依赖的方式增加RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞中TC、FC和CE水平,降低ABCA1表达和胆固醇流出。
　　 2.对氧磷降低了细胞中cAMP的水平及腺苷酸环化酶(AC)的活性和增加磷酸二酯酶(PDE)的活性。
　　 3.cAMP的类似物双丁酰环腺苷酸(dBcAMP)能抑制对氧磷降低ABCA1表达和部分阻断对氧磷降低胆固醇流出的作用。
　　 4.AC激动剂福斯高林(Forskolin)和PDE抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)能拮抗对氧磷降低cAMP的作用。
　　 结论:
　　 对氧磷下调鼠源巨噬细胞性泡沫细胞ABCA1的表达,降低细胞内胆固醇流出和增加细胞内胆固醇堆积可能与干预cAMP信号通路有关。
　　 第四章、对氧磷酶1基因转染对对氧磷促巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响
　　 目的:
　　 观察外源性PON1基因转染对对氧磷促鼠源巨噬细胞性泡沫细胞形成的影响
　　 方法:
　　 1.实验分为以下各组:(1)PAW巨噬细胞组、(2)Ox-LDL+RAW巨噬细胞组、(3)对氧磷+Ox-LDL+RAW巨噬细胞组、(4)对氧磷+Ox-LDL+PON1(+)RAW巨噬细胞组。将外源性的人的PON1基因转染RAW264.7细胞,用Ox-LDL(50μg/ml)诱导泡沫细胞形成,对氧磷处理组加对氧磷(100μmol/1)共孵育48 h。
　　 2.油红染色进行形态学观察,高效液相色谱法测定细胞内TC及FC水平,计算CE水平,测定胆固醇流出率。
　　 结果:
　　 1.Ox-LDL+RAW细胞组细胞内TC、FC、CE水平和CE/T值与RAW细胞组相比显著性增高;对氧磷(100μmol/1)+Ox-LDL+RAW细胞组组细胞内TC、FC、CE水平及CE/TC较Ox-LDL+RAW细胞组均有显著性增加,而PON1转染拮抗了对氧磷的作用。
　　 2.Ox-LDL+RAW组细胞胆固醇流出率与RAW细胞相比显著性增加;与Ox-LDL+RAW细胞组相比,对氧磷(100μmol/l)处理组细胞胆固醇流出率显著性降低,而PON1转染拮抗了对氧磷的作用。
　　 结论:
　　 外源性对氧磷酶1抑制了对氧磷促进鼠源巨噬细胞性泡沫细胞形成的作用

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词

前言

第一章 毒死蜱对高脂饮食致兔AS形成的影响及相关机制研究

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第二章 对氧磷促鼠源巨噬细胞性泡沫细胞形成及机制探讨

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第三章 对氧磷通过干预cAMP信号通路下调鼠源巨噬细胞性泡沫细胞ABCA1表达和胆固醇流出

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第四章 对氧磷酶1基因转染对对氧磷促巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

综述 有机磷杀虫剂与心血管疾病

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