二亚硝基哌嗪(DNP)介导Ezrin磷酸化促进鼻咽癌转移的分子机制研究

摘要

目的:本文检测化学致癌物二亚硝基哌嗪(N，N'-Dinitrosopiperazine，DNP)处理鼻咽癌细胞(6-10B)后的运动侵袭能力，分析DNP对Ezrin和phos-Ezrin(phosphorylated ezrin，phos-Ezrin)表达的调控作用，探讨DNP参与鼻咽癌侵袭转移的分子机制。
　　 方法:
　　 1.鼻咽癌细胞6-10B为低转移、低成瘤鼻咽癌细胞系，来自鼻咽癌母细胞系SUNE-1，作为研究材料。来自同一母细胞系的5-8F，为高转移、高成瘤鼻咽癌细胞株，作为对照细胞。
　　 2.连续稀释法制备不同浓度DNP，将不同浓度DNP处理6-10B细胞，四甲基偶氮唑蓝(Methylthiazolyltertrazolium，MTT)实验分析DNP处理6-10B细胞的非毒性浓度(non-cytotoxic concentration，NCC)。全自动生化仪检测DNP处理6-10B细胞培养液乳酸脱氢酶Lactate dehydrogenas，LDH)，进一步确证DNP非毒性浓度。
　　 3.用DNP非毒性浓度处理6-10B细胞，Western Blotting分析DNP处理6-10B细胞后Ezrin和phos-Ezrin Thr567表达的影响。明确DNP是否诱导6-10B细胞Ezrin或phos-Ezrin Thr567表达。
　　 4.用DNP非毒性浓度处理6-10B细胞，划痕实验和Transwell迁移及侵袭实验分析非毒性浓度的DNP对6-10B细胞迁移运动和侵袭能力的影响。明确DNP是否促进6-10B细胞运动迁移和侵袭。
　　 5.通过尾静脉将6-10B细胞移植在BALB/c裸小鼠体内，皮下注射DNP，处理一定时间后，解剖裸鼠，观察6-10B细胞转移情况，常规病理学检测，确认6-10B细胞是否发生转移。分析DNP在体内对鼻咽癌细胞成瘤和转移的影响。
　　 6.将6-10B转移癌组织病理切片，免疫组化SP方法检测Ezrin和phos-Ezrin Thr567在裸鼠组织中的表达，分析DNP在体内对6-10B细胞Ezrin和phos-Ezrin Thr567表达的影响。
　　 7.利用SPSS17.0统计软件分析数据。
　　 结果:
　　 1.MTT实验和LDH检测结果显示，DNP在高浓度(100μmol/L以上)时对鼻咽癌6-10B细胞生长增殖有明显的抑制作用(P＜0.05)，而在0～100pmol/L时对6-10B细胞的生长没有明显影响(P＞0.05)。DNP处理6-10B细胞的非毒性浓度为0～100μmol/L。
　　 2.Western Blotting分析DNP诱导Ezrin和phos-Ezrin Thr567表达，结果显示不同浓度DNP处理6-10B细胞组和未处理组Ezrin的表达无明显差异(P＞0.05);而DNP处理6-10B细胞phos-Ezrin Thr567表达水平明显高于未处理6-10B细胞(P＜0.05)，且随剂量增加和处理时间延长phos-Ezrin Thr567逐步增高，呈现明显的处理剂量依赖性和时间依赖性。
　　 3.划痕实验结果显示，DNP处理组迁移生长细胞数明显多未处理组;Transwell迁移和侵袭实验结果表明，DNP处理组穿过过滤膜细胞数显著多于未处理组(P＜0.05)，这说明DNP能增强鼻咽癌6-10B细胞迁移和侵袭能力。
　　 4.6-10B细胞移植在BALB/c裸小鼠体内，DNP处理一定时间后，在裸鼠肺组织观察到瘤组织，常规病理检查证实为鼻咽癌细胞肺转移瘤，表明DNP促进6-10B细胞肺转移。
　　 5.转移癌组织免疫组化结果显示，DNP处理组裸鼠肺转移灶phos-Ezrin Thr567的表达明显高于对照组(P＜0.05)，总Ezrin蛋白表达无明显差异。提示DNP通过上调phos-Ezrin Thr567表达促进鼻咽癌6-10B细胞转移。
　　 结论:
　　 1.DNP诱导鼻咽癌6-10B细胞phos-Ezrin Thr567表达，呈现明显的剂量和时间依赖性，但总Ezrin的表达无明显变化。
　　 2.DNP促进鼻咽癌6-10B细胞迁移运动和侵袭能力，DNP可能参与了鼻咽癌侵袭转移。
　　 3.DNP促进鼻咽癌6-10B细胞裸鼠肺转移，上调转移组织phos-Ezrin Thr567的表达，提示DNP可能通过上调phos-Ezrin Thr567表达促进鼻咽癌细胞侵袭与转移。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 主要实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学处理

第三章 结果

3．1 DNP对6-10B细胞非毒性浓度

3．2 Western Blotting检测Ezrin和phos-Ezrin的表达

3．3 划痕实验结果

3．4 Transwell迁移实验结果

3．5 Transwell侵袭实验结果

3．6 裸鼠成瘤及病理切片(HE染色)结果

3．7 裸鼠组织中Ezrin和phos-Ezrin的表达

第四章 讨论

4．1 鼻咽癌的主要临床特点

4．2 化学致癌物DNP与鼻咽癌发生发展

4．3 Ezrin，phos-Ezrin与肿瘤转移

4．4 DNP对鼻咽癌6-10B细胞Ezrin，phos-Ezrin蛋白表达及细胞侵袭转移能力的影响

第五章 结论

参考文献

综述

致谢

在读硕士期间参加的科研项目及发表的学术论文