人支气管上皮细胞5-脂氧合酶介导苯并(a)芘致氧化应激与DNA损伤

摘要

[目的]研究在人支气管上皮细胞(HBE)中5-LOX介导B(a)P产生氧化应激以及氧化损伤作用，为5-LOX介导化学物氧化所致DNA损伤以及癌变的机制提供初步依据，进一步证明RNA干扰是一种有效的抑制5-LOX代谢活化作用的技术。
　　[方法]以不同浓度B(a)P（16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L）染毒正常HBE细胞、经5-LOXshRNA处理的细胞以及载体对照细胞24小时，采用多功能荧光酶标仪测定细胞内活性氧(ROS)水平，分光光度计测量抗氧化酶类过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和非酶类抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)含量，酶标仪检测细胞内8.羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和丙二醛(MDA)。检测特异性5-LOX抑制剂AA861及其它主要代谢酶类抑制剂对上述氧化应激和损伤指标的影响。
　　[结果]B(a)P可诱导HBE细胞内氧化应激指标ROS在B(a)P处理浓度为32、64μmol/L时显著增加(p＜0.05)，抗氧化酶SOD活力随着染毒浓度增加呈先升高后降低趋势(p＜0.01)，CAT活力在B(a)P处理浓度为64μmol/L时显著增强(P＜0.01),抗氧化剂GSH显著降低(P＜0.01);同时在B(a)P处理浓度为32、64μmol/L时还可引起脂质和DNA氧化损伤指标MDA和8-OHdG含量增加(p＜0.05)。AA-861和5-LOXshRNA处理可显著抑制B(a)P所致的氧化应激和氧化损伤水平，且5-LOXshRNA对氧化损伤的抑制作用更为显著。另外，CYP4501A和PGS特异性化学抑制剂a-萘黄酮与萘普生亦可在部分染毒剂量组对B(a)P引起的氧化应激和损伤表现出一定的抑制作用。
　　[结论]AA-861和5-LOXshRNA对B(a)P所致HBE细胞氧化应激及氧化损伤具有保护作用，可能与5-LOX介导的B(a)P代谢活化受到抑制有关，表明HBE细胞内B(a)P可能主要通过5-LOX代谢活化诱导产生氧化应激及DNA氧化损伤，后者与其致癌机制密切相关。而利用RNAi能更有效地抑制5-LOX介导B(a)P产生的DNA损伤作用。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 受试细胞

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要试剂溶液的配制

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 试验设计思路与技术路线

2．2．2 建立5-LOX RNA干扰稳定转染的HBE细胞株

2．2．3 HBE细胞、5-LOXshRNA细胞以及NC细胞的培养和染毒处理

2．2．4 细胞内总蛋白浓度的测定

2．2．5 细胞内活性氧(ROS)检测

2．2．6 细胞内MDA、OAT、SOD活力测定

2．2．7 细胞内谷胱甘肽(QSH)检测

2．2．8 细胞内8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量检测

2．3 统计分析

3 结果

3．1 5-LOX对B(a)P处理后细胞内ROS水平的影响

3．2 5-LOX对B(a)P处理后细胞内抗氧化酶的影响

3．2．1 5-LOX对B(a)P处理后细胞内总SOD活力的影响

3．2．2 5-LOX对B(a)P处理后细胞内CAT活力的影响

3．3 5-LOX对B(a)P处理后细胞内抗氧化剂(GSH)含量的影响

3．4 5-LOX对B(a)P处理后细胞内MDA含量的影响

3．5 5-LOX对B(a)P处理后细胞内8-OHdG含量影响

3．6 氧化应激和氧化损伤指标间的相关性分析

4 讨论

4．1 5-LOX对B(a)P处理后细胞内ROS形成的影响

4．2 5-LOX对B(a)P处理后细胞内抗氧化酶(SOD、CAT)活力的影响

4．3 5-LOX对B(a)P处理后细胞内谷胱甘肽(GSH)含量的影响

4．4 5-LOX对B(a)P处理后细胞内MDA含量的影响

4．5 5-LOX对B(a)P处理后细胞内8-OHdG含量的影响

4．6 5-LOX介导B(a)P氧化活化与氧化应激、氧化损伤的关系

5 结论

参考文献

综述 氧化应激的致癌机制研究

攻读学位期间主要的研究成果

致谢