甲羟戊酸激酶突变导致光敏性汗孔角化症的致病机制研究

摘要

目的:甲羟戊酸激酶(MVK)可将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸。前期研究中在多个光敏性汗孔角化症（DSAP）家系及散发患者中发现MVK基因突变，但是其具体的致病机制不明。本研究拟探讨MVK相关突变导致DSAP的机制，加深对这一疾病的认识。
　　方法:采集正常人和患者外周血，抽提淋巴细胞总RNA， real timePCR和RT-PCR研究mRNA表达水平。构建相关真核表达载体，在HEK293中表达MVK野生型和DSAP相关突变，免疫印迹观察蛋白表达。建立MVK野生型和DSAP相关突变的HEK293稳定表达细胞系，使用放线菌酮(Chcloheximide CHX)抑制蛋白合成，在不同时间点收集蛋白，免疫印迹检测MVK野生型和DSAP相关突变型的半衰期。使用蛋白酶体抑制剂(MG132)，溶酶体抑制剂(CQ)阻断MVK的降解，免疫印迹观察MVK野生型和DSAP相关突变型的降解途径。在HEK293细胞中瞬时表达GFP标签或FLAG标签的MVK野生型和DSAP相关突变型，对过氧化物酶体、线粒体、内质网等细胞器的标志蛋白进行免疫荧光染色，研究MVK野生型和DSAP相关突变型进行亚细胞定位。构建pGEX-4T-2骨架的MVK野生型及DSAP相关突变质粒，在BL21感受态中通过IPTG诱导原核表达GST融合蛋白，GST pull down研究MVK野生型和DSAP相关突变形成同源二聚体的能力。在HEK293细胞中共转GFP标签和FLAG标签的MVK野生型和/或DSAP相关突变型，免疫共沉淀研究MVK野生型和DSAP相关突变型形成同源二聚体的能力。
　　结果:
　　1.A189V突变患者mRNA表达低于正常人;DSAP相关突变蛋白表达低于野生型;
　　2.DSAP相关突变蛋白的降解较野生型蛋白明显加快;DSAP野生型和相关相关突变蛋白主要通过蛋白酶体途径降解;
　　3.MVK野生型和DSAP相关突变型为细胞质分布;MVK野生型和DSAP相关突变与过氧化物酶体、线粒体、内质网没有共定位;
　　4.MVK野生型和A189V可以形成同源二聚体，MVK野生型不能和H312R形成同源二聚体，H312R自身不能形成同源二聚体。
　　结论:
　　1.MVK DSAP相关突变的细胞亚定位没有改变。
　　2.MVK DSAP相关突变蛋白半衰期缩短，通过蛋白酶体途径降解。
　　3.MVKH312R形成同源二聚体的能力有缺陷。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

实验仪器

试剂与耗材

试剂配制

试验用细胞和质粒

前言

第一章 实验方法

1．1 淋巴细胞总RNA提取

1．2 mRNA逆转录PCR

1．3 实时荧光定量PCR

1．4 质粒构建

1．5 突变诱导

1．6 质粒转染

1．7 免疫印迹

1．8 MVK野生型和DSAP相关突变的稳定表达细胞系的建立

1．9 MVK野生型和DSAP相关突变的半衰期的确定

1．10 MVK野生型和DSAP相关突变的降解途径的确定

1．11 MVK野生型和突变型对内质网应激蛋白BIP的影响

1．12 细胞转染和免疫荧光

1．13 GST融合蛋白纯化及GST PULLDOWN

1．14 免疫共沉淀

1．15 考马斯亮蓝染色

第二章 结果

2．1 MVK野生型和DSAP相关突变型亚细胞定位

2．2 患者淋巴细胞株mRNA表达

2．3 MVK野生型和DSAP相关突变瞬时转染蛋白表达

2．4 MVK野生型和DSAP相关突变型HEK293稳定表达细胞系的获得

2．5 MVK野生型和DSAP相关突变型半衰期的确定

2．6 MVK野生型和DSAP相关突变型降解途径的确定

2．7 MVK DSAP相关突变型对内质网应激的影响

2．8 MVK野生型和DSAP相关突变的原核表达和纯化

2．9 MVK野生型和DSAP相关突变型形成同源二聚体的能力

第三章 分析与讨论

第四章 结论

参考文献

综述 甲羟戊酸途径相关的细胞凋亡

致谢

攻读学位期间主要研究成果