血管基膜衍生多功能肽高效工程菌的构建及人肺癌裸鼠移植瘤模型治疗实验

摘要

研究背景：本文采用整合抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤细胞增殖策略，将肿瘤抑素(tumstatin)N端74-98氨基酸功能肽通过人IgG3上游铰链区序列与tumstatinN端197-215氨基酸功能肽连接，获得了一种全新的同时具有抑制血管内皮细胞增殖和抑制肿瘤细胞增殖两种不同抗肿瘤特性的血管基膜衍生多功能肽(Vascularbasementmembrane-derivedmultifunctionalpeptide，VBMDMP)。本课题是在此基础上构建重组VBMDMP同型四聚体可溶性融合蛋白高丰度原核表达质粒pETSUMO-4VBMDMP，转化入BL21(ED3)大肠杆菌获得重组VBMDMP高效工程菌；通过重组VBMDMP裸鼠人肺癌异种移植瘤模型治疗实验评价重组VBMDMP治疗肿瘤的有效性.为重组VBMDMP产业化奠定基础. 方法：将原pUC19-VBMDMP和pUC19质粒分别用HindⅢ和KpnⅠ酶切获得VBMDMPcDNA片段和pUC19cDNA片段，将两者连接后得到新单聚体pUC19-VBMDMP；酶切图谱和测序鉴定后，将新单聚体pUC19-VBMDMP用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切获得VBMDMPcDNA片段，用BclⅠ和EcoRⅠ酶切获得载体cDNA片段，将分别获得的两个片断连接得到pUC19-2VBMDMP，重复以上步骤得pUC19-4VBMDMP；分别酶切图谱和测序鉴定pUC19-2VBMDMP和pUC19-4VBMDMP。测序后以pUC19-4VBMDMP为模板，T/A克隆构建重组pETSUMO-4VBMDMP。重组pETSUMO-4VBMDMP原核表达质粒转化入BL21(ED3)大肠杆菌，IPTG诱导表达4小时，镍亲和层析柱分离纯化，得重组4VBMDMP融合蛋白。同时，用针对tumstatinN端197-215氨基酸功能肽的多克隆抗体，Westernblot分析对重组4VBMDMP进行免疫鉴定。BCA法分别测定pETSUMO-4VBMDMP转化的BL21(ED3)大肠杆菌裂解液和镍亲和层析后获取的等容积洗脱液蛋白质含量，评价pETSUMO-4VBMDMP转化的BL21(ED3)大肠杆菌生产重组VBMDMP的效率。最后应用裸鼠人肺癌异种移植瘤模型治疗实验鉴定重组VBMDMP抗肿瘤活性。　　结果： (1)VBMDMP单聚体，二聚体，四聚体的PCR产物和新单聚体pUC19-VBMDMP、pUC19-2VBMDMP、pUC19-4VBMDMP经酶切图谱和测序分析其序列与设计序列完全一致。　　(2)pETSUMO-4VBMDMP转化的BL21(DE3)大肠杆菌，IPTG诱导4小时，细胞裂解液和镍亲和层析柱洗脱液SDS-PAGE和Westernbolt显示43KD的目的条带，即重组4VBMDMP。　　(3)pETSUMO-4VBMDMP转化的BL21(DE3)大肠杆菌裂解液所含总蛋白量为5.45mg/ml，而镍亲和层析柱洗脱液重组4VBMDMP蛋白含量为2.56mg/ml，该转化菌表达丰度为47％；该转化菌的生产效率是原pGEX-4T-1-VBMDMP转化JM109大肠杆菌生产效率的9.8倍。　　(4)在裸鼠人肺癌异种移植瘤模型治疗实验中，重组VBMDMP(1mg/kg，5mg/kg)的肿瘤生长抑制率分别是42％和74％，瘤重抑制率分别是42％和77％；其效价强度是常规化疗药环磷酰胺的20倍。这些结果表明重组VBMDMP对裸鼠人肺癌异种移植瘤生长具有显著抑制作用。　　结论：　　(1)成功地构建重组VBMDMP同型四聚体可溶性融合蛋白高丰度原核表达质粒pETSUMO-4VBMDMP。　　(2)成功地构建重组VBMDMP高效工程菌即重组pETSUMO-4VBMDMP表达质粒转化的BL21(DE3)大肠杆菌。　　(3)重组VBMDMP在重组pETSUMO-4VBMDMP表达质粒转化的BL21(DE3)大肠杆菌中获得高丰度表达。　　(4)重组VBMDMP对裸鼠人肺癌异种移植瘤生长具有显著抑制作用。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权说明

主要缩略语英文索引

前言

实验材料

实验方法

实验结果

一.Pet-SUMO-4VBMDMP原核表达质料构建

二、重组VBMDMP蛋白纯化和免疫鉴定

三、重组VBMDMP裸鼠人肺癌异种移植模型治疗实验

讨论

结论

参考文献

综述：胶原IV获得性血管形成抑制因子

致谢

感谢

附录