血管基膜衍生多功能肽基因在毕赤酵母中的表达和活性鉴定

摘要

目的利用PCR技术从含有目的基因的质粒pGEX-4T-1-VBMDMP获得带有snabⅠ和NotⅠ酶切位点并融合有GST的目的基因片段并测序鉴定。方法将PCR产物纯化、酶切、回收，克隆到pPIC9K栽体，转化入大肠杆菌DH5a扩增，用琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。BglⅡ线性新构建的表达载体pPIC9K-CST-VBMDMP，然后用原生质体转化法转化毕赤酵母细胞，并用pPIC9K空质粒也转入酵母细胞进行对照。用煮-冻-煮法裂解已转化有目的基因的毕赤酵母细胞，提取DNA并行PCR鉴定，获得阳性重组子，行多克隆筛选和表型鉴定。筛选His’Mut8表型的转化子，在MGY液体培养基中30℃摇床培养，每24h从培养基中转移1mL培养基上清于-70℃保存，并保持培养瓶中培养基的量和培养基中甲醇0．5％的浓度不变。8d后行SDS—PACE检测表达的蛋白，用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化获得GST-VBMDMP融合蛋白；用凝血酶切割GDT—VBMDMP并分离获得VBMDMP。结果VBMDMP能够抑制鼠主动脉内皮细胞管状结构的形成；同时VBMDMP(10、6、2mg/kg)对小鼠Lewis肺癌原发瘤具有显著抑制作用(瘤重抑制率分别为96．6％、82．1％、61．2％)。VBMDMP(GST—VBMDMP 10、6、2mg／kg)对小鼠Lewis肺癌自发性肺转移具有显著抑制作用(自发性肺转移瘤结节抑制率分别为96．8％、87．9％、75．3％)。结论、VBMDMP能够抑制鼠主动脉内皮细胞管状结构的形成，并对小鼠Lewis肺癌原发瘤和肺转移具有明显的抑制作用。