泡沫细胞靶标蛋白的适配子筛选

摘要

目的：运用SELEX技术筛选出与泡沫细胞特异性结合的寡核苷酸适配子，寻找泡沫细胞特异性蛋白质，为动脉粥样硬化的早期体内诊断和治疗确立靶标。 方法：体外合成随机单链DNA文库，通过反复筛选、富集，得到与THP-1巨噬细胞源性的泡沫细胞特异性结合的单链寡核苷酸适配子。将体外合成的适配子与不同细胞来源的泡沫细胞及脂肪肝、脂肪和动脉组织进行特异性结合实验。通过油红O染色和HPLC检测细胞内荷脂情况，运用荧光显微镜观察适配子结合的特异性。用终浓度为100nmol/L的PMA诱导THP-1细胞72小时，使其分化成巨噬细胞，再用80mg/Lox-LDL共孵育72小时，诱导成泡沫细胞。将泡沫细胞与生物素标记的适配子共孵育40分钟，裂解细胞，利用生物素链霉亲和素磁珠分离得到结合适配子的泡沫细胞蛋白，经1D-SDS-PAGE(一维聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离、LC-ESI-TRAP(液相色谱-电喷雾离子阱质谱)串联质谱鉴定，分析。通过蛋白质免疫印迹方法，验证蛋白质在泡沫细胞中表达的特异性。 结果：运用SELEX技术平台筛选得到了与巨噬细胞源性的泡沫细胞特异结合的23号适配子，为长81nt，5’端标记生物素的单链寡核苷酸。Ox-LDL诱导的THP-1 细胞、平滑肌细胞、RAW264.7细胞，经油红O染色和HPLC验证细胞泡沫化程度；荧光检测结果显示：23号适配子仅与THP-1细胞源性、RAW264.7细胞源性的泡沫细胞及有粥样硬化病变斑块的主动脉有特异性结合，和平滑肌细胞、平滑肌源性的泡沫细胞及脂肪肝、脂肪组织不结合。生物素-链霉亲和素系统提取THP-1细胞源性的泡沫细胞蛋白，1D-SDS-PAGE分离蛋白质，分别经银染和R-250考马斯亮蓝染色后，显示有三个蛋白组分，这三个蛋白组分分别经串联质谱检测得到部分序列信息，使用Mascot软件搜寻NCBInr数据库。共有包括Vimentin（波形蛋白）在内的12种蛋白得到鉴定，且得分均不低于域值42。经比对和分析，挑选出靶蛋白2和波形蛋白，经WESTERN-BLOTTING实验检测发现，靶蛋白2在ox-LDL诱导的THP-1泡沫细胞高表达，而在未处理的THP-1巨噬细胞中无表达；波形蛋白在未用ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞有少量表达，ox-LDL处理后蛋白显著增加。 结论： 1. 证明本研究采用的SELEX技术平台筛选出的适配子（23号适配子，为长81nt，5’端标记生物素/FITC的单链寡核苷酸）具有巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变结合的特异性。 2. 利用适配子特异性结合蛋白的特性，通过生物素链霉亲和素磁珠分离、串联质谱鉴定，分析，得到泡沫细胞候选靶标蛋白12个。 3.初步鉴定出候选靶标2号具有THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的特异性，可能成为动脉粥样硬化的早期体内诊断和治疗的新靶标。