糖尿病大鼠门静脉胰岛细胞移植后CD62L、CD34表达的变化

摘要

目的： 1、探讨STZ（链脲佐菌素）建立1型糖尿病大鼠模型的最适合剂量。 2、探讨成年SD大鼠胰岛细胞分离、纯化以及胰岛细胞质量的鉴定方法；胰岛细胞门静脉移植前后外周血血糖、CD62L（LECAM-1，L-选择素）以及胰岛细胞移植（PIT）后肝组织内CD62L、CD34的表达变化，探讨PIT后排斥反应发生的可能机制，为临床应用胰岛细胞移植治疗糖尿病提供实验依据。 材料和方法： 1、建立糖尿病大鼠模型：将120只Wistar大鼠随机分为五组，A组： NS组，NS腹腔内注射；B组：柠檬酸缓冲液组，柠檬酸缓冲液腹腔内注射；C组：链脲佐菌素（STZ）腹腔内注射（55mg/Kg）；D组：STZ腹腔内注射（65mg/Kg）；E组：STZ腹腔内注射（75mg/Kg）。观察注射后外周血血糖值、尿糖值、大鼠体重、饮水量及一般情况的变化，根据刘学政等[1]成模标准判断五组的成模率。 2、①成年SD大鼠胰岛细胞分离、纯化和质量鉴定：经胆总管内逆行灌注胶原酶V的方法消化胰腺组织，Ficoll400非连续密度梯度离心纯化消化产物，获得胰岛细胞后双硫腙（DTZ）染色、吖啶橙-碘丙啶（AO-PI）双染色，结合糖刺激胰岛素释放试验鉴定胰岛细胞的纯度、活率等。②门静脉胰岛细胞移植（PIT）后CD62L、CD34的表达变化：40只Wistar糖尿病大鼠随机分为四组，A组：模型组，不做任何处理；B组：手术组，门静脉移植达尔伯克(氏)必需基本培养液（DMEM液，0.8～1.0ml∕kg，含糖5.6mmol/L），术前一天开始腹腔注射NS；C组：生理盐水组，门静脉移植已分离纯化的胰岛细胞，术前一天开始腹腔注射NS；D组：免疫抑制剂组，术前1天开始腹腔注射CsA（３mg／kg/d）+ MMF（20mg／kg/d）。其中C组、D组胰岛细胞移植物来自SD大鼠，提取两只正常SD大鼠胰岛细胞供给一只Wistar大鼠糖尿病模型。以血糖仪检测外周血血糖；单克隆抗体流式细胞仪技术检测外周血CD62L的表达；免疫组织化学SP法检测肝组织CD62L、CD34的表达。 结果： 1、A组、B组成模率为0，C组成模率为8.33％，D组和E组成模率为91.67％；成模率比较：A组与B组无显著差异（P>0.05）, C组与D组、E组差异显著（P<0.01），D组与E组无显著差异（P>0.05）；D组和E组大鼠注射STZ后血糖值明显增高、体重增加明显减缓或不增加，一般情况较差，饮水量和大小便量明显增加；A、B、C、D四组成模后2周内死亡率均为零，E组大鼠死亡6只，达27.3％，且感染率高达50％。 2、①大鼠胰腺经消化、纯化后获得的胰岛细胞数为430-690个胰岛/胰腺，平均为520士70个胰岛/胰腺，存活率在90％以上，纯度为85％ 以上，胰岛素释放试验显示大鼠胰岛细胞经高糖刺激后胰岛素分泌是低糖刺激分泌的2.7倍（P<0.05）。表明胰岛细胞功能良好。②模型组和手术组比较：外周血血糖值、CD62L，肝组织内CD62L，CD34的表达未发现显著性差异（P>0.05）；NS组和免疫抑制组比较：外周血血糖值、CD62L，肝组织内CD62L、CD34的表达有显著性差异（P<0.01）。③NS组和免疫抑制组比较：不论是否使用免疫抑制剂，外周血血糖与外周血CD62L及外周血血糖与肝组织内CD62L的表达变化呈正相关；外周血血糖与肝组织内CD34的表达呈负相关。④ PIT后，免疫抑制剂组（D组）与未使用免疫抑制剂组（C组）比较：D组CD62L的表达相对较低，血糖控制较好，正常血糖时间维持较长，差异具有显著性（P<0.01）。 结论： 1、STZ是目前建立胰岛素依赖型糖尿病大鼠模型的最适合药物之一， 65mg/Kg的剂量具有成模率高、死亡率低、感染率低等优点。 2、①经胆总管逆行注入消化酶V，Ficoll400不连续密度梯度离心是消化分离、纯化胰岛细胞有效的方法之一。②PIT后，NS组较免疫抑制剂组CD62L在外周血和肝组织内表达显著增高，血糖控制较差，提示机体可能通过抗体识别抗原（胰岛细胞），CD62L表达增高，使分子与分子或分子与基质之间黏附增强来参与机体对胰岛移植物的排斥反应过程。③ PIT后，免疫抑制剂组较NS组肝组织内血管内皮细胞标记物CD34表达明显增高，血糖值控制较好，提示胰岛细胞移植后再血管化过程可能与机体对胰岛移植物的排斥反应有关。