表达外源性人胰岛素基因人骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病的研究

摘要

目的：构建携带外源性人胰岛素基因重组逆转录病毒表达载体转染人骨髓间充质干细胞(hMSCs)，获得稳定表达人胰岛素基因的hMSCs，观察移植治疗大鼠糖尿病的疗效。探讨β细胞替代治疗的细胞新来源。 方法：1.利用密度梯度离心法从健康成年人骨髓中分离出hMSCs进行培养；2.通过RT-PCR法从人胰腺组织中提取人胰岛素基因片段，将其连接到逆转录病毒载体pLNCX上，构建重组逆转录病毒表达载体pLNCX/hIns，经过包装细胞P67包装后获得具有感染能力的病毒载体.；3.将重组表达载体pLNCX/hIns转染hMSCs，G418抗性筛选出阳性克隆后培养扩增，获得成功转染的hMSCs，利用RT-PCR法、免疫荧光法、放射免疫法检测转染后hMSCs对人胰岛素基因的转录、表达，并进行体外葡萄糖刺激释放实验；4.通过腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导健康SD大鼠为糖尿病模型；5.将分泌胰岛素hMSCs体外传代扩增后移植到糖尿病大鼠的肾包膜下，检测移植后血糖、血清胰岛素、C肽、体重、尿量、生存时间及腹腔糖耐量实验(IPGTT)等指标，观察治疗大鼠糖尿病的效果；6.对移植物进行病理学分析。 结果：成功构建携带外源性人胰岛素基因的逆转录病毒载体pLNCX/hIns。经包装细胞P67包装后重组表达载体获得感染能力，成功转染hMSCs后，外源性人胰岛素基因整合到hMSCs基因组中并可以稳定表达。hMSCs在体外能够持续合成与分泌胰岛素。体外葡萄糖刺激释放实验为阴性。大鼠在STZ诱导后，血糖显著上升，出现典型的多饮、多食、多尿、体重下降等症状，生存时间缩短。将分泌胰岛素的hMSCs移植到大鼠肾包膜下后，大鼠的血糖水平下降，胰岛素、C肽水平上升，体重增加，糖尿病症状得到控制，生存时间明显延长，IPGTT接近正常水平。4周后在部分动物模型的移植部位可见新生物长出，组织学分析可见典型的胰岛样结构，免疫组化显示胰岛素染色阳性。 结论：通过重组逆转录病毒载体pLNCX/hIns可以将外源性人胰岛素基因导入hMSCs中并稳定表达。转基因hMSCs在体外、体内均可以合成与分泌有生物活性的胰岛素，有效改善大鼠糖尿病症状，延长生存时间。为运用基因工程技术获得理想的β细胞替代物提供了新的研究方向。

目录

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摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

糖尿病细胞治疗进展

致谢

附图