中国南海新芋螺毒素基因的克隆及进化分析

摘要

芋螺毒素是海洋软体动物芋螺分泌的一类具有神经药理活性的多肽，多数由12～46个氨基酸残基组成，富含二硫键，且具有相对分子质量小、结构稳定、活性高、选择性强及易于合成等突出优点。它们能特异性地作用于钙、钠、钾等多种离子通道及乙酰胆碱受体、NMDA受体等多种受体亚型，已成为药理学和神经科学研究的探针与新药开发的宝库。我国芋螺资源丰富，尚有大量芋螺毒素的种类、结构和功能未曾得到阐明。
　　目的：本研究旨在发现具有独特氨基酸序列、二硫键排列方式的新芋螺毒素,建立和完善稀有芋螺毒素资源库，为下一步芋螺毒素的功能研究和开发应用奠定坚实的基础。这将具有十分重要的理论意义和实用价值。
　　方法：以中国南海7种芋螺为研究对象，根据芋螺毒素高度保守的信号肽序列，通过3’RACE和巢式PCR的技术，从芋螺毒腺管的总RNA中克隆新毒素序列，并采用BioEdit、ClstalX1.83和Mega5.05等软件进行序列和进化分析。对具有新型半胱氨酸框架的毒素进行5’端扩增，得到完整的cDNA序列。
　　结果：
　　1、得到了60个新的毒素，涵盖A、M、O、J等各超家族，其中A超家族2个，J超家族11个，M超家族10个，O超家族22个，其他超家族10个（S超家族2个，conomarphin家族4个，contryphan家族1个，I超家族3个），同时还发现了2个新的框架，将其命名为框架XXIV（2个）和XXV（3个）。
　　2、获得了含有20个的半胱氨酸的新毒素，采用5’RACE对新毒素的5’端进行扩增，获得了完整的cDNA序列，这也是首次在芋螺毒素中发现含有20个半胱氨酸的多肽组分。
　　3、新发现的芋螺毒素在序列上与已报道的芋螺毒素相比差异显著：2个α4/7型的新A超家族芋螺毒素的第二个和第三个半胱氨酸之间的V和I氨基酸很少有发现；在 M超家族芋螺毒素中发现了含有半胱氨酸数目较少或者不含半胱氨酸的新毒素；O超家族芋螺毒素的Pro区同源性小，成熟肽的氨基酸序列与已报道的有很大不同；11个新的J超家族芋螺毒素除具有 CX3CX8CXC和CX3CX10CXC骨架外，还发现了一种新的骨架CX3CX9CXC。
　　4、对新发现的M、O和J超家族芋螺毒素的进化分析表明：新的M超家族芋螺毒素分散在进化树的不同分支，即使是来自同种芋螺的毒素同源性很低，位于进化树的不同分支；O超家族芋螺毒素中，除O3家族的新毒素集中单独位于一个小分支外，其余新毒素同源性较低，位于进化树的不同分支；J超家族新芋螺毒素除Di14.1和Mr14.2与已报道的芋螺毒素有同源性外，其他新毒素同源性较低，均位于进化树上的分支Ⅱ。
　　结论：
　　1、获得了60个新毒素和29个已知的芋螺毒素，新毒素分布在A、M、O、J等超家族。
　　2、发现了2个新的框架，将其命名为框架XXIV和XXV。
　　3、首次在芋螺毒素中发现含有20个半胱氨酸的多肽组分。

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主要英文缩略词

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英文摘要

1 引言

1.1. 芋螺简介

1.2. 芋螺毒素

1.3. 芋螺毒素的研究进展

1.4. 本实验研究的目的、内容和意义

2 材料与方法

2.1. 材料

2.2. 方法

3 结果

3.1. 新芋螺毒素的克隆

3.2. 新毒素的cDNA序列

4 讨论

4.1. 新毒素的序列分析

4.2. 新毒素的进化分析

5 结论

参考文献

综述：芋螺毒素研究进展

附录1 发现的已报道的芋螺毒素

附录2 成果目录

致谢