小麦近缘种谷蛋白新亚基鉴定与编码基因克隆及其分子进化分析

摘要

小麦谷蛋白是贮藏蛋白中的主要成分，由高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)两部分组成。HMW-GS与LMW-GS的含量及组成可直接影响小麦面粉的加工和烘烤品质。研究显示，粗山羊草(Aegilopstauschii，DD，2n=2x=14)的Glu-1Dt位点编码的HMW-GS变异类型丰富，且大多为普通小麦中尚未发现的新类型。栽培一粒小麦(TriticummonococcumL.，AmAm，2n=2x=14)的Glu-1Am位点编码的LMW-GS等位基因出现的变异频率也非常高，因此从小麦近缘种中寻找新的候选优质谷蛋白基因对小麦品质改良具有重要意义。本研究以粗山羊草和栽培一粒小麦为材料，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、等电聚焦双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF×SDS-PAGE)、高效毛细管电泳(HPCE)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)等多种方法对HMW-GS和LMW-GS进行分离和鉴定，然后设计等位基因特异PCR(AS-PCR)引物对其编码基因进行分子克隆、序列测定与结构比较，分析贮藏蛋白基因家族的分子进化关系和预测谷蛋白的二级结构特征，并将来自粗山羊草和硬粒小麦的HMW-GS编码基因连接到表达载体上，使其在E.coli中高效表达，初步探讨其表达特性。主要研究结果如下： 1.粗山羊草HMW谷蛋白新亚基的分离与鉴定。利用SDS-PAGE，在粗山羊草T16、T132和T128中初步鉴定出了3个新的x-型HMW-GS，分别命名为1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t，同时发现一些新的亚基组合，如1Dx1.6t+1Dy12.4t，1Dx3t+1Dy10.1t和1Dx5.2t+1Dy12t。然后采用IEF×SDS-PAGE、HPCE和RP-HPLC三种分离方法对以上新亚基和亚基组合进一步表征和鉴定。结果发现，2-DE分离除1Dy12t和1Dy10.1t亚基外，其他亚基均分离出不同的多个蛋白组分，1Dx型亚基一般包括2-4个蛋白点。同时，在HPCE图谱中，这些亚基多表现为一个主峰加1-2个副峰，由此推测这些HMW-GS可能存在蛋白质的翻译后修饰。对粗山羊草HMW-GS的RP-HPLC分析表明，1Dx亚基疏水性大于1Dy亚基，这反映了它们理化性质的不同。MALDI-TOF-MS测得的1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t亚基的精确分子量分别为88565.8Da、86934.5Da和86651.2Da。 2.粗山羊草HMW-GS编码基因的分子克隆、序列比较和进化分析。根据HMW-GS编码基因5’和3’端的保守序列，设计了一对扩增1Dx型亚基的AS-PCR引物，以含有新亚基的粗山羊草T16、T132和T128的基因组DNA为模板扩增，均获得了约2500bp左右的单一条带，分别回收并克隆到T-Easy载体上，DNA测序后得到1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t亚基编码基因的全序列，分别命名为1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t。基因1Dx3t和1Dx5.2t已登陆GenBank，编号为DQ307383和DQ307384。 1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t的DNA序列全长为2541bp、2514bp和2514bp，以ATG起始密码子开始，双终止密码子TGATAG结束，分别编码845个、836个和836个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有典型的HMW-GS的序列结构特征，由21个氨基酸的信号肽、89个氨基酸的N-端(3个Cys)、三肽，六肽和九肽构成的中央重复区和42个氨基酸的C-端(1个Cys)四个部分组成。氨基酸序列比较显示：1Dx5.2t与优质亚基1Dx5的相似性较高，都含有5个Cys，1Dx5.2t亚基的额外Cys位于重复区第278位，此外预测的二级结构中β转角的含量均较高，因此该基因很有可能是优质候选基因。1Dx1.6t和1Dx3t亚基氨基酸序列推导的成熟蛋白的分子量，均比质谱测得的种子中亚基的精确分子量小，其差异在270.3-787.5Da之间，进一步表明这些x-型HMW-GS亚基可能存在翻译后修饰，如糖基化或磷酸化等。另外，三个亚基基因序列中存在着丰富的单核苷酸多态性(SNPs)，共检测到29个SNPs，其中有义突变为63％，多数为谷氨酰胺/甘氨酸→精氨酸突变。进化分析表明：来自粗山羊草的x-型亚基与普通小麦中的1Dx亚基同源性很高，基因和氨基酸序列的相似性达到97％-99％。 3.克隆基因的原核表达。设计两对不含有信号肽的表达引物，分别扩增硬粒小麦Simeto中的y-型亚基基因1By8和粗山羊草的1Dy12.2t(已由本实验室克隆)及x-型亚基基因1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t，扩增片断克隆到表达载体pET28a或pET30a上，转化表达菌株BL-21(DE3)plysS与Rosetta(DE3)plysS。IPTG诱导后，以上五个HMW-GS编码基因均在E.coli中获得了高效表达。SDS-PAGE分析表明，体外表达的蛋白与种子中的HMW-GS迁移率基本相同。Western检测显示，E.coli中表达的蛋白和种子蛋白均与HMW-GS多克隆抗体出现较强的杂交信号。这些体外表达的蛋白纯化后，可进行亚基功能的进一步鉴定。 4.栽培一粒小麦LMW-GS编码基因的鉴定、分子克隆与进化分析。通过SDS-PAGE，在栽培一粒小麦Mo-M1、Mo-M3和Mo-M5中鉴定出三个新的LMW-GS，命名为LMW-M1、LMW-M3和LMW-M5。利用MALDI-TOF-MS获得了它们的精确分子量。以一对LMW-GS的AS-PCR引物对编码基因进行扩增，测序后得到完全DNA序列，包括上游、开放阅读框和下游，均无内含子。根据推导出的氨基酸序列，三个基因即LMW-M1、LMW-M3、LMW-M5均编码LMW-i型亚基，分子量在38520.6Da-38720.8Da之间，小于质谱测定的分子量。三个基因已登录GeneBank，编号为DQ307388，DQ307389和DQ345449。氨基酸序列比较显示，它们与普通小麦中已克隆的LMW-i型基因有较高的相似性，但同时也具有独特的特征。尤其在LMW-M5基因的C-端，除了含有8个保守的半胱氨酸残基之外，还发现一个额外半胱氨酸残基。这是首次报道的含有九个半胱氨酸残基的LMW-i型亚基，半胱氨酸残基的增加会提高谷蛋白的粘弹性，因此LMW-M5可能为优质亚基。LMW-GS二级结构预测显示：N-端保守区和中央重复区的氨基酸大部分或全部形成β转角或无规则卷曲；C-端保守区氨基酸则主要形成a螺旋、β折叠和β转角；四种构象单元中，a螺旋和β折叠含量很少，β转角较丰富。此外，在三个基因中共发现25个SNPs和一个插入缺失(InDels)突变。分子进化分析表明：LMW-i型基因与LMW-m和LMW-s型基因差异较大，从LMW-GS基因家族中分化出来的时间较早，大约在12.92百万年，而Am和A基因组的分化时间为3.98百万年。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词目录

第一章文献综述

一、小麦贮藏蛋白的组成

二、小麦贮藏蛋白的分离分析方法

三、小麦高分子量谷蛋白(HMW-GS)

四、低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)

五、分子生物学方法在谷蛋白研究上的应用

六、立题依据和论文设计

第二章粗山羊草高分子量谷蛋白亚基的分离与鉴定

第三章 粗山羊草高分子量谷蛋白亚基编码基因的克隆、序列测定及分子进化分析

一、实验材料

二、实验方法

三、结果与分析

四、讨论

第四章 高分子量谷蛋白亚基编码基因在大肠杆菌中的体外表达

第五章 栽培一粒小麦中低分子量谷蛋白亚基编码基因的分子克隆与鉴定

一、实验材料

二、实验方法

三、结果与分析

四、讨论

结 论

参考文献

作者简历

致 谢