鹦鹉热嗜衣原体禽鸟株的分离、鉴定与基因分型

摘要

目的：优化鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci，C.psittaci，Cps）禽鸟株分离鉴定培养技术，通过测序及进化树分析ompA基因的多态性，研究Cps的种系发育史及获得可靠Cps感染的流行病学资料，掌握衡阳地区Cps的流行病学特征，从而为Cps感染的预防、诊断、治疗措施提供依据。
　　方法：收集衡阳地区可疑的禽鸟标本，利用分子生物学技术，提取禽鸟肝组织全基因组DNA，设计MOMP特异性引物，PCR扩增约264bp的基因片段，用1.7％琼脂糖凝胶电泳分离。将PCR阳性禽鸟标本肝组织匀浆液接种到单层敏感细胞株人喉癌上皮细胞（Hep-2）细胞和非洲绿猴肾细胞(Vero)中培养，免疫荧光染色法（IF）鉴定Cps包涵体，免疫荧光显微镜下观察两种细胞内包涵体形态的变化。按照文献设计另一对MOMP特异性引物，PCR扩增约1000bp的基因片段，用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，将阳性PCR产物进行纯化后送往测序公司进行测序，同时从Genebank中获得Cps各型参考株的ompA基因序列，利用软件ClustalX2和MEGA3构建系统进化树分析临床株与各参考株之间的亲缘关系。通过BLAST分析8例标本基因间的相似性。
　　结果：
　　通过 PCR扩增及测序的方法从591例禽鸟标本（其中鹦鹉425只，鸽子23只及其它类型禽鸟143只）中检测到8例阳性，其中7例来源于鹦鹉，染率约为1.64%，1例来源于相思鸟。鸽子的染率为0%，其它类型禽鸟的染率约为0.69%；8例阳性标本在Hep-2及Vero细胞中成功培养出7株，成功率为87.5%；通过Cps在Hep-2细胞与Vero细胞中培养生长情况的比较，发现Hep-2细胞在原代培养时其胞内包涵体形成单位（IFU）数量大于 Vero细胞，培养三代后免疫荧光染色发现，Vero细胞内的IFU数量较Hep-2细胞大；对8例阳性禽鸟标本PCR产物ompA基因序列进行测序，测序结果与Cps各型参考株ompA序列进行软件分析，系统进化树显示其中7例为A型，另外一例暂未能分型；将8例阳性禽鸟标本PCR产物ompA基因序列与C. psittaci6BC标准株ompA基因进行BLAST分析，Cps6BC与其中7例的相似度在92%～99%之间，另外一例与Cps6BC的相似度仅为58%；将E9的ompA基因与Genebank中其它已知菌株基因进行比对也未能对其进行确定。
　　结论：
　　（1）成功分离Cps禽鸟株7株，并完善了Cps阳性禽鸟株分离鉴定培养技术；
　　（2）衡阳地区Cps可能主要以鹦鹉为其宿主，以基因型A为主要型别，且存在一定的变异。

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主要缩略语英文索引

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英文摘要

1 前 言

实 验 材 料

1. 主要仪器设备

2. 临床标本、菌株及细胞株

3. 主要实验试剂

2 实验方法

1 标本的采集与处理

2 C.psittaci MOMP基因的体外扩增初筛临床阳性标本

3 鹦鹉嗜衣原体临床株的细胞培养及免疫荧光鉴定

4 初筛阳性标本MOMP（ompA）基因PCR扩增

5 初筛阳性标本的测序与分型

3 实 验 结 果

1 C. psittaci ompA编码基因的PCR扩增结果

2 PCR初筛阳性的标本来源

3. PCR初筛阳性标本中C. psittaci的分离鉴定

4. C. psittaci在Hep-2和Vero细胞中培养情况的比较

5. 阳性禽鸟标本C. psittaci ompA编码基因的PCR扩增

6. 基因分型

7. 阳性禽鸟标本PCR产物ompA基因序列与C. psittaci 6BC标准株BLAST分析

8. 禽鸟标本E9 ompA基因序列与Genebank中其它菌株基因比对分析结果

4．讨论

5 结 论

参考文献

附录

[文献综述]

研究成果及发表文章

致谢