流产嗜性衣原体和鹦鹉热嗜性衣原体保护性抗原MOMP和MIP共表达载体及其构建和表达方法

摘要

本发明公开了一种流产嗜性衣原体和鹦鹉热衣原体保护性抗原MOMP和MIP共表达载体及其构建方法和表达方法，利用分子克隆技术分别将流产嗜性衣原体的主要外膜蛋白(MOMPa)和巨噬细胞感染增强因子(MIPa)、鹦鹉热嗜性衣原体的主要外膜蛋白(MOMPp)和巨噬细胞感染增强因子(MIPp)编码基因分别与双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1连接，构建共表达载体。本发明提供的共表达载体同时携带流产嗜性衣原体和鹦鹉热嗜性衣原体MOMP和MIP四个蛋白基因，并能够在同一宿主菌中表达，可以用于制备多价衣原体基因工程亚单位疫苗，防控多血清型的动物传染病，有利于提高我国动物衣原体病的防治技术水平，保证家畜养殖业健康发展、提高农牧民收入、保证公共卫生和畜产品安全。

说明书

技术领域

本发明涉及一种衣原体保护性抗原MOMP和MIP共表达载体的构建和表达方法，属 于生物领域。

背景技术

衣原体是一类革兰氏阴性专性细胞内寄生性原核生物，能够感染人和动物，引 起多种疾病。流产嗜性衣原体(Chlamydophila abortus)和鹦鹉热嗜性衣原体 (Chlamydophila psittaci)衣原体是两种常见的动物疫病病原，由于结构和致病 机制的相似性，均能感染牛、绵羊、山羊和猪等多种动物，具有相同的宿主范围。 其中流产嗜性衣原体主要寄生于动物的胎盘滋养层细胞，引起胎盘炎症从而导致怀 孕母畜流产、早产、死胎、木乃伊胎或弱胎，还能引起感染动物发生流产及肺炎、 肠炎、多发性关节炎等症状。感染鹦鹉热嗜性衣原体的动物通常表现为脑炎，脑脊 髓膜炎，肺炎，肠炎，结膜炎，多发性关节炎及流产等症状。在许多动物流产及其 他的病例中都曾发现这两种衣原体混合感染的情况，因此，流产嗜性衣原体和鹦鹉 热嗜性衣原体混合感染对畜牧业造成了巨大的经济损失。

针对上述问题，本领域曾尝试研发了活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗等 新型疫苗，但是这些疫苗在自然界存在重组、失活的可能性。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种流产嗜性衣原体(Chlamydophila  abortus)和鹦鹉热嗜性衣原体(Chlamydophila psittaci)的主要外膜蛋白(MOMP) 和巨噬细胞感染增强因子(MIP)共表达载体构建方法及其表达方法，本发明的构建 方法能够同时表达流产嗜性衣原体和鹦鹉热嗜性衣原体MOMP和MIP四个蛋白，有效提 高动物衣原体病的防治水平，保证家畜养殖业的快速发展。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

流产嗜性衣原体和鹦鹉热衣原体MOMP和MIP共表达载体，载体为pETDuet-1和 pRSFDuet-1，载体上分别连接有流产嗜性衣原体的主要外膜蛋白MOMP_a和巨噬细胞感 染增强因子MIP_a、鹦鹉热嗜性衣原体的主要外膜蛋白MOMP_p和巨噬细胞感染增强因子 MIP_p编码基因。

上述pETDuet-1和pRSFDuet-1，在连接相关蛋白的编码基因后在同一宿主菌中进 行表达。

相应的，本发明提供了上述流产嗜性衣原体和鹦鹉热衣原体MOMP和MIP共表达载 体的构建方法，通过将流产嗜性衣原体的主要外膜蛋白MOMP_a和巨噬细胞感染增强因 子MIP_a、鹦鹉热嗜性衣原体的主要外膜蛋白MOMP_p和巨噬细胞感染增强因子MIP_p编码 基因分别与双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1连接，构建共表达载体。

通过上述方法构建的共表达载体，可以将携带四个基因的两个载体转化进入同 一宿主菌，从而得到能够稳定、高效表达MOMP_a、MIP_a、MOMP_p和MIP_p四种蛋白的菌株， 作为疫苗其表达的四种抗原蛋白能与流产嗜性衣原体和鹦鹉热嗜性衣原体的阳性血 清发生反应，具有很好的免疫原性并且能诱导产生较好的免疫保护力，能够抵御流 产嗜性衣原体和鹦鹉热嗜性衣原体的攻击。

具体的，所述构建方法包括下述步骤：

1)利用PCR方法扩增MOMP_a、MIP_a、MOMP_p和MIP_p蛋白编码基因；

2)利用NdeI酶切pETDuet-1、pRSFDuet-1和pET-32a(+)载体，将酶切后的 pETDuet-1、pRSFDuet-1分别与酶切后的pET-32a(+)载体序列片段在T4DNA连接酶的 作用下连接得到改造后的pETDuet-1和pRSFDuet-1载体；

3)将改造后的两个载体进行EcoRI、PstI双酶切，MOMP_a和MIP_p的编码基因分别 用EcoRI、PstI双酶切，将改造后的pETDuet-1双酶切产物、改造后的pRSFDuet-1双 酶切产物与MOMP_a编码基因双酶切产物、MIP_p的编码基因双酶切产物分别在T4DNA连接 酶作用下进行连接得到表达载体；

4)对步骤3)所得表达载体分别进行BglII、XhoI双酶切，对MIP_a和MOMP_p的编码 基因进行BglII、XhoI双酶切，然后将pETDuet-MOMP_a双酶切产物与MIP_a编码基因双酶 切产物、pRSFDuet-MIP_p双酶切产物与MOMP_p编码基因双酶切产物在T4DNA连接酶的作 用下连接得到pETDuet-MOMP_a-MIP_a和pRSFDuet-MIP_p-MOMP_p表达载体。

在上述方法中，载体pETDuet-1、pRSFDuet-1是双表达载体，每一个载体上有两 个启动子，每一个外源基因都有独立的一个启动子，每个启动子独立驱动各外源蛋 白的表达，与传统的构建融合基因相比，采用本发明的方法避免了两个基因之间的 相互影响，保证了外源蛋白稳定表达，克服了串联表达表达量不足的缺点。

本发明采用的双质粒表达系统，pETDuet-1和pRSFDuet-1是复制子相同不相容的 两个质粒，能够在Amp和Kana两种抗生素存在的压力下保证子代菌才能够存活，因此 可以同时转化进入同一宿主菌后能够有效的表达外源毒素基因，这是本发明与现有 技术中的其它技术方案相比所具有的突破性的技术优势。

其中，步骤2)采用NdeI对pETDuet-1、pRSFDuet-1和pET-32a(+)酶切，切开的 pET-32a(+)的315bp小片段为Trx-tag，回收，冉将切开的pETDuet-1和pRSFDuet-1 分别与Trx-tag片段连接，将读码框正确插入的pETDuet-1和pRSFDuet-1在大肠杆菌 中扩增。通过此种方式，本发明利用pETDuet-1、pRSFDuet-1第二个多克降位点(MCS2) 的NdeI位点插入了Trx-tag，使表达的外源蛋白在N端融合Trx标签，使4个蛋白在同 一个宿主菌中共表达时，条带能够分得开，便于SDS-PAGE和WB检测。

其中，步骤3)为改造后的pETDuet-1双酶切产物连接MOMP_a编码基因双酶切产物， 步骤4)为pETDuet-MOMP_a表达载体的双酶切产物连接MIP_a编码基因双酶切产物，从而 得到共表达载体pETDuet-MOMP_a-MIP_a和pRSFDuet-MIP_p-MOMP_p。

在步骤1)中，PCR扩增所用引物(下划线部分为酶切位点)分别为

MOMP_a-F：CTCGAATTCCGCAAGCCTTGCCTGTAGGGAAC(含EcoRI酶切位点)

MOMP_a-R：GGCCTGCAGGAATCTGAATTGAGCATTC(含PstI酶切位点)

MIP_a-F：CGCAGATCTCTGTGATCAGAGTTCTC(含BglII酶切位点)

MIP_a-R：CCGCTCGAGATGAAGCTGTGTTTTTGTC(含XhoI酶切位点)

MOMP_p-F：CGCAGATCTCCAAGCCTTGCCTGTAGGGAA(含BglII酶切位点)

MOMP_p-R：CCGCTCGAGGAATCTGAATTGAGCATTCATG(含XhoI酶切位点)

MIP_p-F：CATGAATTCCGTGTAATCAGAGTACTCCAA(含EcoRI酶切位点)

MIP_p-R：CGCCTGCAGTGAAGCTGTGTTTTTGTCCTC(含PstI酶切位点)。

通过上述构建方法，本发明所得共表达载体进入同一菌株后得以携带四个基因 从而同时高效、稳定的表达四种蛋白，能与流产嗜性衣原体和鹦鹉热嗜性衣原体的 阳性血清发生反应，具有很好的免疫原性并且能诱导产生较好的免疫保护力，能够 抵御流产嗜性衣原体和鹦鹉热嗜性衣原体的攻击，是一种较为理想的疫苗。

在上述基础上，本发明还公开了所述流产嗜性衣原体和鹦鹉热衣原体MOMP和MIP 保护性抗原共表达载体的表达方法，通过将所得共表达载体转化到宿主菌涂板，过 夜培养，挑取单克隆菌落接种于LB培养基中，摇菌过夜，转接至新LB培养基中，加 入IPTG进行诱导。

其中，培养最终达到OD值0.6-0.8，所用IPTG浓度为0.8mM/L。

其中，所用的载体菌株采用适合于外源蛋白表达的菌株，优选的是BL21(DE3)、 BL21(DE3)PLySs等。

进一步的，本发明还公开了一种多价衣原体基因工程亚单位疫苗，包括含有上 述共表达载体的的宿主菌。

上述疫苗可以用发酵罐规模化生产，可以实现质量控制，保证所生产的疫苗安 全有效；本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白质，与其他新型疫苗(如活载体疫苗、核 酸疫苗、基因缺失疫苗)相比不会发生可能出现基因重组问题，因此不存在生物安 全性问题，可大规模推广应用。

附图说明

图1为四种蛋白共表达载体构建图；

A为pETDuet-MOMP_a-MIP_a酶切鉴定，M，DL10000；1，NdeI酶切；2，EcoRI/PstI 双酶切；3，BglII/XhoI双酶切，M’，DL2000；

B为pRSFDuet-MIP_p-MOMP_p酶切鉴定，M，DL10000；1，NdeI酶切；2，EcoRI/PstI 双酶切；3，BglII/XhoI双酶切，M’，DL2000；

图2为四种蛋白诱导表达的SDS-PAGE图；

其中，M为marker，1为对照菌体蛋白，2为转化pETDuet-MOMP_a-MIP_a的菌体蛋白， 3为转化pRSFDuet-MIP_p-MOMP_p的菌体蛋白，4为共转化pETDuet-MOMP_a-MIP_a和 pRSFDuet-MIP_p-MOMP_p的菌体蛋白；

图3为四种表达的蛋白抗原性分析图；

A为标签抗体(抗His和Trx标签抗体)为一抗的Western blot结果，1，对照菌 体蛋白；2，共转化表达载体的菌体蛋白；

B为阳性血清(牛血清)为一抗的Western blot结果，1，对照菌体蛋白；2，共 转化表达载体的菌体蛋白。

具体实施方式

在下述实施例中，本发明提供了所述技术方案的一个具体实现路径，并提供了 具体所采用的各种试剂类型，然而本发明并不仅限于，采用其它的实验方式，只要 得以得到本发明的共表达载体即为本发明的保护范围。

在下述实施例中，所使用的主要材料包括：

流产嗜性衣原体菌株、鹦鹉热嗜性衣原体菌株，可从菌株公司购买。在试验中 为标记方便，分别命名为SX5，D13。

pETDuet-1和pRSFDuet-1双表达载体，pET-32a(+)载体，购自Novagen公司。

表达菌：BL21(DE3)是四个毒素蛋白的表达宿主菌，购自北京全式金生物技术 有限公司。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

酶和试剂：限制性内切酶NdeI、BglII、EcoRI、PstI、XhoI，T4 DNA连接酶和 2×Power Taq PCR MasterMix均购自大连宝生物有限公司；IPTG、SDS(十二烷基磺 酸钠)、核酸Marker、Agarose DNA extraction kit、DNA快速纯化回收试剂盒、质 粒快速提取试剂盒均购自大连宝生物工程公司；细菌基因组提取试剂盒购自上海生 工生物工程有限公司合成；琼脂糖购自Invitrogen公司；预染蛋白Marker购自 Fermentas公司。

1.MOMP_a、MIP_a、MOMP_p和MIP_p蛋白编码基因的扩增

分别挑取少许保存的C.abortus菌株SX5和C.psittaci菌株，利用革兰氏阴性 细菌基因组提取试剂盒提取SX5和D13的基因组DNA，并以此为PCR模版扩增出各个目 的基因，反应体系中包括：25μL的2×Power Taq PCR MasterMix，相应的上下游 引物各2μL，2μL的DNA模版，去离子水补足50μL。PCR产物用DNA胶回收试剂盒 回收，从而得到四个蛋白目的蛋白的编码基因。

2.pETDuet-1和pRSFDuet-1载体的改造(字体)

将pETDuet-1和pRSFDuet-1和pET-32a(+)载体分别用NdeI酶切，40μL酶切体 系：10×H缓冲液4μL，NdeI各2μL，载体24μL，去离子水10μL，用胶回收试 剂盒回收切开的pETDuet-1和pRSFDuet-1，将切开的pET-32a(+)的315bp小片段(即 Trx-tag编码基因)也同样回收；冉将切开的pETDuet-1和pRSFDuet-1分别与315bp 的Trx-tag编码基因连接，连接体系：10×T4DNA Ligase Buffer2.5μL，Trxt-ag 编码基因胶回收产物14μL，pETDuet-1或者pRSFDuet-12μL，T4DNA Ligase1μL， 去离子水5.5μL。对改造后的载体测序，将Trx-tag读码框正确插入的pETDuet-1 和pRSFDuet-1在大肠杆菌中扩增，备用。

3.pETDuet-1-MOMP_a和pRSFDuet-1-MIP_p载体的构建

将改造后的pETDuet-1和pRSFDuet-1两个载体分别进行EcoRI、PstI双酶切， 40μL酶切体系：10×H缓冲液4μL，EcoRI、PstI各1μL，载体24μL，去离子 水10μL，酶切产物1％琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。MOMP_a和MIP_p的编码基因分 别用EcoRI、PstI双酶切，40μL酶切体系：10×H缓冲液4μL，EcoRI、PstI各1μL， 目的基因24μL，去离子水10μL，酶切产物1％琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收， 然后分别与双酶切的pETDuet-1、pRSFDuet-1的载体连接，两个连接体系分别是：① 10×T4DNA Ligase Buffer 2.5μL，MOMP_a编码基因胶回收产物14μL，pETDuet-1 2μL，T4DNA Ligase 1μL，去离子水5.5μL；②10×T4DNA Ligase Buffer 2.5μL， MIP_p编码基因胶回收产物14μL，pRSFDuet-1 2μL，T4DNA Ligase 1μL，去离 子水5.5μL。16℃连接过夜，分别转化Trans109感受态细胞，挑取单克隆菌落分 别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定，并对构建的载体测序，确定成功构建了 pETDuet-MOMP_a和pRSFDuet-MIP_p表达载体。

4.pETDuet-MOMP_a-MIP_a和pRSFDuet-MIP_p-MOMP_p载体的构建

对pETDuet-MOMP_a和pRSFDuet-MIP_p进行BglII、XhoI双酶切，40μL酶切体系：10 ×H缓冲液4μL，EcoRI、PstI各1μL，载体24μL，去离子水10μL，酶切产物1％琼 脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。用BglII、XhoI双酶切的MIP_a和MOMP_p的编码基因， 40μL酶切体系：10×H缓冲液4μL，EcoRI、PstI各1μL，目的基因24μL，去离 子水10μL，酶切产物1％琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。回收的酶切产物分别与切 开pETDuet-MOMP_a和pRSFDuet-MIP_p载体连接两个连接体系分别是：①10×T4DNA  Ligase Buffer 2.5μL，MIP_a编码基因回收产物14μL，pETDuet-MOMP_a回收产物2μL， T4DNA Ligase 1μL，去离子水5.5μL；②10×T4DNA Ligase Buffer 2.5μL，MOMP_p的编码基因胶回收产物14μL，pRSFDuet-MIP_p回收产物2μL，T4DNA Ligase 1μL， 去离子水5.5μL。16℃连接过夜，分别转化Trans109感受态细胞，挑取单克隆菌落 分别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定(附图1)，并对构建的载体测序，确定成功构建 了pETDuet-MOMP_a-MIP_a和pRSFDuet-MIP_p-MOMP_p表达载体。

5.MOMP_a、MIP_a、MOMP_p和MIP_p四个蛋白的共表达

将pETDuet-MOMP_a-MIP_a和pRSFDuet-MIP_p-MOMP_p表达载体各0.5μL，同时转化BL21 (DE3)宿主菌，涂板，过夜培养，挑取单克隆菌落接种于新鲜10ml LB培养基中， 摇菌过夜，按1∶100比例转接新鲜10ml LB培养基中，OD值达0.6-0.8时取1ml菌 液作为末诱导样品，其余加入终浓度0.8mM的IPTG，诱导4h，每小时收取1ml菌液 样品。

在上述基础上，对四种蛋白进行SDS-PAGE检测(图2)。

6.1溶液的配制：

Tris-甘氨酸缓冲液：25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸(pH8.0)、0.1％SDS。

2×SDS上样buffer：100mmol/L Tris Cl(pH8.0)、200mmol/L疏基乙醇、4％SDS、 0.2％溴酚蓝、20％甘油。

考马斯亮蓝染色液：45ml甲醇、45ml水、10ml冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮 蓝R250。

脱色液：30％甲醇、10％冰乙酸，蒸馏水补体积至100ml。

6.2SDS-PAGE

(1)洗净玻璃板，固定在电泳槽上，用2.0％琼脂糖封边。常规方法配制15％的分 离胶5ml，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖1ml双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆 盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置空干液体，加入2ml 5％的浓缩胶溶 液，插上梳子，垂百放置电泳槽使其凝固。

(2)小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液，用注射器 冲洗加样孔数次，将电源负极与上槽相连。

(3)收集的菌液12 000rpm离心2min，用50μl pH7.4的PBS悬浮，加入等体 积的2×SDS上样buffer，混匀，水浴煮沸10min，用微量进样器上样10μl，打开 电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到120V，继续电泳至溴酚 蓝到达凝胶底部。

(4)染色：取下凝胶用蒸馏水冲洗，用5倍凝胶体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝 胶，放在脱色摇床上室温染色3h。

(5)脱色：用30％甲醇、10％冰乙酸的混合液，在脱色摇床上脱色过夜，其间更 换染色液3～4次。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。

同时，本发明还进行了四种蛋白的免疫原性检测(Western Blot)，参考图3。

SDS-PAGE结束后，取下凝胶，切掉浓缩胶，根据分离胶的大小裁剪合适的PVDF 膜，然后将膜在甲醇中浸泡20s，转移至去离子水中漂洗一下，最后置于蛋白转移 液中浸泡5min。在蛋白转移液中按照滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序铺好，注 意凝胶对应负极，膜对应正极，夹紧夹子，放入转移槽内，接通电源，350mA转渍 150min，将蛋白转印至PVDF膜上。将膜置于5％脱脂奶粉中封闭非特异性蛋白质， 室温，2h。将膜置于标签抗体或阳性血清工作液中，在摇床上4℃摇晃过夜，PBST 洗膜4次，每次15min，将膜置于二抗工作液中，在摇床上，室温摇晃孵育1.5h， PBST洗膜4次，每次15min。洗涤结束后，用去离子水清洗PVDF膜一次，稍微晾 干，将膜置于塑料保鲜膜内，在暗室中等量混合ECL显色系统中A、B液，滴加至PVDF 膜上，作用1min；裁剪X-胶片，放在膜上，盖上胶片夹，曝光适当时间，取出胶片 显影，定影，扫描胶片，进行分析。

从附图1可看出，本发明的共表达载体可以同时成功表达四个目的蛋白，从图2、 3可以知道，这些蛋白可以有效分离，具有良好的免疫原性，具有工业生产前景。