16S rRNA/rDNA序列分析技术应用于环境微生物群落的初步研究

摘要

微生物是废水处理、城市生活垃圾填埋或堆肥处理等系统中的主要功能生物，充分认识其中的微生物学原理能为改进处理工艺、提高处理效率提供依据；此外，污染环境的土著微生物也是污染自净的重要作用者，深入了解其存在状况可以为这些污染环境的原位或异地恢复提供有力的微生物学根据。但是，目前研究环境微生物群落的主要方法仍是基于培养和分离纯化的传统技术，已经无法满足研究者对环境微生物进行快速、准确的分析与鉴定的要求。利用基于16S rRNA/rDNA 序列分析的分子生态学技术，研究者可以在不对微生物进行分离培养的情况下对其进行研究，甚至还可以利用原位核酸杂交和原位PCR 技术对特定环境中的微生物进行原位分析鉴定，并对微生物群落的结构和功能进行研究，结果快速、准确。 本论文提出和改进了溶菌酶法、超声波破碎法和蛋白酶K-CTAB法等3种方法从环境样品（本论文中以复杂的堆肥为例）直接提取微生物DNA，细胞直接计数表明三种方法对细胞的破碎效率均达到了94％以上，分光光度法检测表明纯化后的DNA中腐殖酸浓度低于20 ng/μl，A260/280值为1.7～1.8，使用16S rDNA引物对27F/1495R 和GC341F/907R 进行PCR扩增，均得到了特异性很强的扩增产物，利用PCR产物进行的限制性片段长度多态性分析和变性梯度凝胶电泳分析都表明，3种方法提取的DNA中有一致的微生物遗传多样性，因而能够应用于环境微生物分子生态学研究。 为了初步了解堆肥中的细菌群落及其动态变化情况，使用餐厨垃圾进行为期18天的小规模堆肥，高温阶段（温度高于50℃）共7天，最高温度达到65℃，使用蛋白酶K-CTAB法从偶数天和高温阶段堆肥样品中提取总DNA，并使用16S rDNA引物对GC341F/907R进行PCR-DGGE 分析，结合统计分析、条带测序和系统发育分析对其中的细菌进行分子生态学研究。结果表明随温度升高，堆肥中细菌多样性下降，不同时期的优势菌群不同，高温阶段细菌种群以嗜热的芽孢杆菌属细菌为主。 为了研究序批式生物膜反应器中脱氮细菌的群落结构及种群变化情况，使用垃圾渗滤液对一个3L反应器内的生物膜进行3个月的驯化后，正常运行一个月，从垃圾渗滤液、驯化结束、正常运行的一个周期内共取样8个，使用溶菌酶法提取总DNA，并使用16s rDNA引物对GC341F/907R进行PCR-DGGE分析，结合使用统计分析、16S rDNA克隆测序和系统发育分析对生物膜细菌进行分子生态学研究。结果表明，载体上形成了种群比较丰富、群落结构与功能比较稳定的生物膜，其中包括好氧反硝化细菌、厌氧氨氧化细菌、大量的硝化细菌和厌氧反硝化细菌，因而该反应器中可能同时存在传统硝化反硝化、同步硝化反硝化和厌氧氨氧化3种脱氮形式；在运行过程中的不同周期和单个周期的不同时刻，细菌群落组成都没有发生明显的变化；驯化的生物膜中的细菌可能主要来自于渗滤液，而用于接种的常规污水处理厂污泥对脱氮生物膜的形成贡献可能并不大。