一种基于16S rDNA全长高通量测序检测根际细菌群落的方法

摘要

本发明是一种基于16S rDNA全长高通量测序检测根际细菌群落的方法，由以下步骤构成：1.采集不同基因型植物在各发育时期的根区外土壤(作为系统对照)及根际土壤；2.从各样品土壤中提取微生物总DNA；3.用双标签引物法做PCR扩增上述总DNA中16S rDNA全长片段以构建文库；4.对合格文库用PacBio Sequel II平台进行CCS模式测序；5.得到纯净的成对READS后拼接，每样品产出至少1万条有效TAG用于聚类成可操作分类单元；6.据系统对照，准确测定各样品根际土壤细菌群落组成、结构、多样性、相对丰度显著性分析，并比较不同植物之间的异同。

说明书

技术领域

本发明属于土壤微生物学技术领域，16S rDNA全长高通量测序检测植物根际细菌群落 的方法。

背景技术

根际(Rhizosphere)，一般是指紧密围绕着有生命力植物根系的生物活性区域，离根轴表 面数毫米范围之内(一般为0.3cm以内)，是土壤-根系-微生物相互作用的微区域。根际区 域大量微生物，包括细菌、真菌和放线菌，也包括一些藻类和病毒等。因为受植物根系活动 影响，其在物理、化学和生物学性质上(如根际pH和微生物组成、丰度和活性等)不同于 作为对照的土壤本身。在这一微区中进行着活跃的物质转化和流通以及动力学过程。植物根 系和微生物的相互作用，直接影响着植物的生长发育、水分和养分的吸收利用，对逆境的调 节反应，以及有益和有害微生物的存活与繁殖、种类和丰度的变化。因此，根际是当今植物 营养学科中新兴的边缘学科分支，是涉及土壤化学、植物学和微生物学的前沿交叉学科。

由于根系生长在土壤中，无法被人为直接观测。在研究过程中，对于根系和根际部位土 壤的定义与采样，发展了不同的研究方法。传统的根际部位的土壤采样方法为抖落法，即将 易于从根系上抖落的土壤称为土体土壤(即抖落土)，和根系紧密结合不易抖落的土壤称为 根际土壤。这种方法较为粗放，但至今仍为人们广泛使用。目前，产生了多种对根际土壤进 一步细分的研究方法，如以PBS缓冲液刷洗、离心，以及PBS缓冲液超声震荡等，为进一 步有目的性和更细致的研究根际土壤的微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度提供了理 论指导和技术支持。

不同植物甚至同一植物的不同生育期，其根系分泌物会对根际微生物的生长繁殖产生影 响；而根际微生物又可以参与土壤中有机物质的分解、腐殖质的形成、养分的转化和循环等 多种生理生化过程。准确检测不同基因型植物包括转基因作物的根际微生物群落组成、结构、 多样性及相对丰度差异，是判断和评价不同基因型植物对土壤微环境影响的重要基础，是研 究微生物群落参与植物生长和发育作用的必要前提，也是评估转基因作物种植对土壤微生态 影响的重要基础。

运用PCR技术扩增细菌基因组中的16S rRNA基因(简称16S rDNA)或是真菌基因组中的18S rDNA、ITS区域并测序分析，可以对微生物进行分类鉴定，该技术已经普遍应用到探讨微生物的多样性、鉴定微生物的种类以及系统发育关系等领域。基于PCR的分析方法大致分为三阶段：第一，样品的核酸提取和纯化；第二，目的基因的PCR扩增；第三，扩增片 段的测序与分析，例如16S rDNA测序技术等。16S rDNA是细菌分类学研究中最常用的“分 子钟”，其序列包含9个可变区(Variable region)和10个保守区(constant region)，其中 的可变区因细菌物种不同而异，且变异程度与细菌的系统发生密切相关。通过检测16S rDNA的序列变异和丰度，可以了解环境样品中群落多样性信息。16S测序随着DNA测序技术的 发展大致可以分为三个阶段。第一阶段以ABI 3730测序仪为代表的第一代测序，该方法凭 借其长的序列片段和高的准确率，可以对16S/18S/ITS rDNA进行全长测序，可辅助常规菌 种鉴定方法，提高菌种鉴定的准确度。该方法只适用于能够分类培养的单菌株的物种鉴定，而目前为止，环境中99％以上的菌株都是不能分离培养的(Journal of Bacteriology，DOI： 10.1128/JB.180.18.4765-4774.1998)，这也就大大限制了第一代测序的应用范围。第二阶段以 16S rDNA可变区扩增子高通量、低成本为主要特征的第二代测序，该方法具有高通量、高 准确度、低成本的优点，可以广泛应用于不能分类培养群落的菌种鉴定，是目前常用的16S rDNA测序平台(Illumina HiSeq/MiSeq)；由于读长的限制，二代测序只能对16SrDNA的 某一或某几个可变区进行测序，如V4/V3-V4/V1-V3/V4-V5等，在物种分类鉴定准确度上 难以达到第一代测序的水平。2013年中科院周宁一教授在AEM发表的文章比较了16S不同 测序区域的测序结果，研究结果表明，V4-V5区域是最佳的测序区域，造成的基因组内异质 性最小，这也是目前被广泛使用的测序区域之一(Applied and EnvironmentalMicrobiology， DOI：10.1128/AEM.01282-13)。但是，毫无疑问，测序长度越长，对可变区的覆盖度越高， 分类结果越好越可信。以单分子和长读长为主要特征的第三代测序可以实现高通量16S rDNA 全长测序，不需要分离培养，即可获得群落中所有微生物的16S rDNA全长信息，达到第一 代测序的物种鉴定准确性和第二代测序的应用广度。目前第三代测序成本较高，限制了第 三代测序的大范围应用；随着测序通量的提升和成本的下降，第三代测序技术及生物信息学 分析有望替代第二代的成为微生物群落研究的主要方法。

将所有物种都鉴定到种是不能100％实现的，这主要是受到了16S rDNA分辨率以及物种 注释数据库的限制。相比于第二代测序对于16S rDNA的某一或某几个可变区进行测序，全 长16S rDNA高通量测序可以将更多的可操作分类单元(OTU)分类到种水平，并鉴定出更 多的细菌物种。在人粪便样本中，全长16S rDNA测序可以将近90％的OTU鉴定到种；而在 V4区扩增子高通量测序中，分类到种的比例仅有30％至50％。原则上，由于全长16SrDNA 高通量测序对样本DNA的要求低，任何微生物群落样本都可以用来做全长16S测序。

此外，土壤中的微生物群落是一个复杂的多元结构复合体。土壤中死亡微生物破碎细胞 的“残余DNA”(Helic DNA)可保存数周至数年。虽然人们默认从土壤中提取的微生物DNA 主要代表完整的活细胞基因组DNA，但2016年Paul Carini等发现，传统第二代测序技术得 出的结果中，平均约40％的原核和真菌微生物DNA序列信息都是细胞外的或来自不再完整 的细胞；并且，细胞外残余DNA的序列信息使所分析到的原核和真菌丰富度比真实的活微 生物群体的增加了55％，并导致了对于活微生物群体的OTU相对丰富度，特别是对关键生 态系统过程不可或缺的OTU相对丰富度的严重误估(Nature Microbiology，DOI：10.1038/nmicrobiol.2016.242)。因此，这些微生物细胞死亡后残留在土壤中的“残余DNA”会严重影响我们对于实验结果的分析和评估。而通过对全长16S rDNA序列的第三代测序平台的扩增及高通量测序检测，可以避免“残余DNA”的短序列片段，特别是16S rDNA不同可变区的短序列片段的干扰，因此比第二代测序技术显著避免“残余DNA”对于测序结果和分析 的影响。

本方法基于第三代高通量测序平台PacBio Sequel II，起始样品为环境样本提取得到的微 生物总DNA(包括部分“残余DNA”)，经高保真PCR系统反应合成16S rDNA全长扩增子， 然后经损伤修复，末端修复，与已知接头连接，酶反应消化，Blue Pippin分选，最终得到 哑铃形的文库，经过Agilent 2100和Qubit HS检测合格后进行PacBio上机测序及后期数据分 析和结果解读。我们在通常的16S全长扩增测序(使用KAPA HiFi HotStart PCRKit)的基础 上，优化了扩增体系(总共只有一轮PCR反应)和程序。首先，为了降低扩增循环数，样品 总模板量增加至100ng；其次，我们减少了高保真PCR扩增的循环数为(由30降为28)， 这也降低了由扩增循环数过高带来的对样品中起始DNA实际丰度的改变。接着，我们优化 了PCR使用的高保真酶，我们使用Platinum Pfx DNA聚合酶(Platinum Pfx DNAPolymerase) 替代KAPA HiFi HotStart PCR试剂盒，它不仅提供高保真度，同时，Platinum抗体技术提供 简单的自动热启动方法，提高了PCR的特异性，而且可用于扩增不同来源样本提取的DNA 模板而不受影响。最后再通过后续的建库测序，进行结果解读和分析。以上改动确保我们可 以更好地得到质量合格的文库序列，更利于我们通过16S rDNA全长高通量测序的方法，检 测细菌群落的组成、结构、多样性及相对丰度。

发明内容

本发明需要解决的问题是克服现有第二代高通量技术的活细胞检测准确度较低、在原核 微生物的种(Species)分类比例明显偏低以及对不可培养微生物的覆盖度低等不足，提供一 种基于16S rDNA全长高通量测序技术，用以检测不同土壤微生物包括作物根际微生物的方 法，也可为不同基因型作物包括转基因作物及其受体品种对根际土壤微生物群落影响的准确 评估提供一种新方法。

本发明的技术方案：

本发明所述基于16S rDNA全长高通量测序检测不同土壤原核微生物包括作物根际细菌 的方法，由以下步骤构成：

(1)大田试验地设计，每种基因型作物(例如：大豆、玉米、小麦等)种植于三个或三个 以上小区，每个小区面积不小于20m

(2)先除去地面杂草和枯枝落叶，铲除大田土壤表面1至2cm的表土，然后将在盛花期或 或鼓粒期或成熟期的作物植株连根从土中挖取出，取根区外土壤作为系统对照，混合均匀并去除根毛，于零下20℃-零下70℃保存，再用捋取法或刷取法收集紧粘于作物 根的根际土壤，混合均匀并去除断根及根毛，并于零下70℃保存；

(3)从上述各土壤样品中，用可去除土壤中残留的腐殖质及几乎所有其他的PCR抑制因子 的PowerSoil DNA Isolation Kit(QIAGEN(MoBio Laboratories Inc.)Carlsbad，CA， USA)提取高质量微生物宏基因组DNA；

(4)50ng至100ng基因组DNA样品，加入全长扩增primer，充分混匀，按照特定设置的 PCR热循环参数进行扩增。这里使用的正向引物为27F：5’-Barcode- -gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcac-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3’，反向引物为1492R： 5’-Barcode-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtag-RGYTACCTTGTTACGACTT-3’。通过实验比 对我们选择的PCR循环数为28，高保真PCR酶为Platinum Pfx DNA聚合酶(Platinum Pfx DNAPolymerase)。接着进行PCR产物纯化，并检测PCR产物浓度和片段范围是 否合格。按照预定方案多个样品PCR产物按照一定比例进行pooling，充分混匀。配 制反应体系，进行DNA的损伤修复和末端修复。配制接头连接反应体系，进行接头 连接；配制反应体系进行酶反应消化。根据2100送检结果，选取适当的起始片段分 选长度，作为Blue pippin分选。最后分别使用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent DNA 12000 Reagents)和Qubit HS检测文库的片段大小及浓度。

(5)对合格的文库用测序平台：PacBio Sequel II平台进行CCS模式测序。推荐数据量：6K reads/sample，或者12 Sample/cell。

(6)把纯净的成对READS拼接，然后聚类成“可操作分类学单元”(英语缩写为OTU)，再做物种组成、结构、多样性及相对丰度差异的显著性分析；

(7)以根区外土壤微生物群落的组成、结构及多样性作为系统对照，克服土壤异质性的影 响，准确测定根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度，比较不同大豆之间的异同。

系统对照为大田种植方式下的大豆根系抖落土壤或根区外土壤，每种基因型作物的系统 对照土壤样品至少3个生物学重复，每种基因型作物的根际土壤样品至少3个生物学重复。 所述的高质量宏基因组DNA用PowerSoil DNA Isolation Kit提取。其中的土壤样品的均质化 通过在高通量组织研磨仪(Grinder-48，骋克仪器)上60Hz振荡500s来完成。

本发明的有益效果是：通过对全长16S rDNA序列的第三代测序平台的扩增及高通量测 序检测相比于二代测序技术，对可变区的覆盖度越高，分类结果更可信，且可以将更多OTU 分类到种水平，并鉴定出更多的物种。同时，相比第二代测序技术，又可以避免“残余DNA”’ 的短序列片段，特别是16S rDNA不同可变区的短序列片段的干扰对于测序结果和分析的影 响。此外，我们优化了PCR使用的高保真酶，我们使用Platinum Pfx DNA聚合酶(Platinum Pfx DNA Polymerase)替代KAPA HiFi HotStart PCR试剂盒，它提供高保真度且提高了PCR 的特异性。最后，增加模板量并减少了高保真PCR扩增的循环数，降低了由扩增循环数过高 带来的对样品中起始DNA实际丰度的改变。准确检测不同基因型植物包括转基因作物的根 际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异，是判断和评价不同基因型植物对土壤微 环境影响的重要基础，也是评估转基因作物释放对土壤微生态风险的重要基础，本发明提供 的一种基于16S rDNA全长的高通量测序检测大豆根际土壤原核微生物的方法，为不同基因 型作物包括转基因作物及其受体品种对根际土壤原核微生物群落影响的准确评估提供了一 种新方法。该方法检测更全面，测序深度更深，分类效果更好，更能避免“残余DNA”以及扩 增数过高的影响，结果也更为可靠。

附图说明

图1大豆根际土壤(Rh)高质量微生物宏基因组DNA的检测结果。

图2大豆根际土壤(Rh)中原核微生物ALPHA多样性分析结果。

图3大豆根际土壤(Rh)中原核微生物群落基于OTU的主成分分析(PCA)结果。

图4大豆根际土壤(Rh)中原核微生物群落的BETA多样性偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)结果。

图5大豆根际土壤(Rh)中超过95％的主要细菌类别，在属(genus)分类水平上相对丰度的差异分析。

图6大豆根际土壤(Rh)中主要细菌类别在种(species)分类水平上相对丰度的差异分 析。

图7单个小区对角线交叉五点采样示意图。

具体实施方式

1.大豆材料：中黄10号(对照品种)；ZH10-6含G2-EPSPS及GAT耐除草剂基因。

2.田间试验设计：

(1)大田试验地点在北京市顺义区中国农科院顺义实验基地，每一种基因型作物(例如大 豆)种植于三个或三个以上小区，每个小区面积150m

(2)先除去地面杂草和枯枝落叶，铲除大田土壤表面1至2cm的表土，然后将在盛花期或 或鼓粒期或成熟期的作物植株连根从土中挖取出，取根区外土壤作为系统对照，混合均匀并 去除根毛，于零下20℃-零下70℃保存，再用捋取法或刷取法收集紧粘于作物根的根际土壤， 混合均匀并去除断根及根毛，并于零下70℃保存；

(3)从上述各土壤样品中，用可去除土壤中残留的腐殖质及几乎所有其他的PCR抑制因子 的PowerSoil DNA Isolation Kit(QIAGEN(MoBio Laboratories Inc.)Carlsbad，CA，USA)提取 高质量微生物宏基因组DNA；

(4)50ng至100ng基因组DNA样品，加入全长扩增primer，充分混匀，按照特定设置的PCR热循环参数进行扩增。这里使用的正向引物为27F： 5’-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3’，反向引物为1492R： 5’-RGYTACCTTGTTACGACTT-3’。通过实验比对我们选择的PCR循环数为28，高保真PCR 酶为Platinum Pfx DNA聚合酶(Platinum Pfx DNA Polymerase)。接着进行PCR产物纯化，并 检测PCR产物浓度和片段范围是否合格。按照预定方案多个样品PCR产物按照一定比例进 行pooling，充分混匀。配制反应体系，进行DNA的损伤修复和末端修复。配制接头连接反 应体系，进行接头连接；配制反应体系进行酶反应消化。根据2100送检结果，选取适当的 起始片段分选长度，作为Blue pippin分选。最后分别使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent DNA 12000 Reagents)和Qubit HS检测文库的片段大小及浓度。

(5)对合格的文库用测序平台：PacBio Sequel II平台进行CCS模式测序。推荐数据量：6K reads/sample，或者12 Sample/cell。

(6)把纯净的成对READS拼接，然后聚类成“可操作分类学单元”(英语缩写为OTU)，再 做物种组成、结构、多样性及相对丰度差异的显著性分析；

(7)以根区外土壤微生物群落的组成、结构及多样性作为系统对照，克服土壤异质性的影 响，准确测定根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度，比较不同大豆之间 的异同。