通过16S rDNA序列分析研究幽门螺杆菌根除疗法对肠道菌群的影响

摘要

目的和意义: 研究目前国内外普遍关注临床上大量采用的幽门螺杆菌根除治疗方案在肠道微生态平衡打破方面的作用及其对肠道微生态的影响。本研究通过16S rDNA基因序列分析观察质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI）、阿莫西林、克拉霉素组成的三联疗法根除治疗幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hpylori）感染对肠道菌群的影响。通过研究三联疗法根除Hpylori感染对肠道微生态平衡打破方面的作用及其对肠道微生态的影响，对于指导临床用药，研究新的抗Hpylori感染治疗方法以及减少药物副作用等具有重要意义；同时为构建环境和临床标本中微生物的快速测定基因芯片提供研究基础。 方法: 1.研究对象; 20-25名志愿者被告知将接受一次13C尿素呼气试验，该试验对机体无任何损害，对Hpylori感染诊断的敏感性和特异性高于90%。这些志愿者均填写知情同意书并接受一次问卷调查，合格的志愿者符合下列标准：13C呼气试验阳性，且近5周内未使用任何制酸剂、益生菌、抗生素或和抗微生物制剂，消化系统无其它器质性疾病，消化道未进行过手术活动，无酗酒史，无糖尿病及影响肠道菌群的其它问题。最后共有12名志愿者符合情况，包括8名男性和4名女性，平均年龄为34岁（年龄范围为23-58岁）。所有的志愿者都填写了知情同意书。 被13C呼气试验证明为H.pylori感染的12名志愿者在浙江大学医学院第一附属医院口服给予为期7天的标准三联疗法（阿莫西林1000mg，2次/天，饭后服；克拉霉素500mg，2次/天，饭后服；雷贝拉唑20mg，2次/天，饭前服），对治疗期间出现的药物副作用详加记录。这些志愿者治疗期间的饮食习惯与平常一样，治疗期间所有志愿者不再服用任何制酸剂、益生菌、抗生素，治疗结束后4周复查13C呼气试验评价是否根除成功。 2.标本收集; 每个志愿者在接受治疗前一天（0天）和一周疗法结束后一天（第8天）各采集粪便10克。采集的粪便与10ml生理盐水混匀，分装10支（每支1ml）至1.5ml液氮冻存管于液氮中保存。标本采集完全后，运送到中国疾病预防控制中心传染病控制所诊断室的实验室，所有粪便标本-72℃保存。 3.细菌DNA提取; 每份标本取0.5ml（约相当于0.5g粪便）用GENMED粪便细菌DNA分离试剂盒自粪便标本中提取细菌总DNA。提取的核酸用紫外分光光度计测定其浓度。 4.PCR扩增及其产物纯化; 利用2个通用引物扩增细菌16S rRNA基因的全长，PCR扩增选用细菌通用引物序列为：8F（5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’）和1492R（5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’），该引物对绝大数细菌16S rDNA基因序列具有特异性。PCR反应混合液包括0.5μl EXTaq酶（2.5u ml-1，TaKaRa生物，中国大连），5μl10×EXTaq Buffer（plusMg2+），4μl dNTP mixture（各2.5MM），上下游引物（10μmol/L）各0.5μl，8-Methoxypsoralen（8-MOP）0.5μl（2.5mg/ml），去离子水定容至49μl，将未加模板的混合液在室温下用紫外线照射后再加1μl模板；PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s、52℃退火1min、72℃延伸1.5min，共25个循环；72℃最后延伸5min，阴性对照用去离子水代替模板，扩增反应在My CyclerTM thermal cycler上进行。PCR产物用经GelRedTM染色的1%琼脂糖凝胶电泳（缓冲液为1×TAE buffer）鉴定，图像用GelDoc凝胶成像仪观察，1.5kb DNA条带自凝胶上切下，PCR产物纯化按Qiaquick PCR gel extraction kit说明书操作步骤进行。 5.16S rDNA克隆文库的建立和序列分析; 经纯化的PCR产物与pGEM-T easy载体连接，然后按操作说明转入大肠杆菌DH5a感受态细胞，重组的克隆子在LB琼脂平皿（包括100mg/ml的氨苄青霉素，20mg/ml的X-Gal和24mg/ml的IPTG）上生长，每份标本随机挑选100个白色克隆子传代于含100mg/ml氨苄青霉素的LB平皿上，37℃培养过夜后，将克隆子送公司测序。短期4℃保存连接后转化克隆平皿，若测序中需补充克隆时，进行补充挑选。用CHIMERA-CHECK程序检测序列中可能出现的嵌合体，每个16S rDNA序列（大约1500bp）同时用GenBank的BLAST和RDP数据库进行比对，若某个序列在两个数据库中同时为一类则该序列归为此类，若某个序列在两个数据库不匹配则按RDP数据库中最相似的进行归类。 6、统计分析; 治疗前和治疗后细菌特征的改变如培养条件、致病性用卡方检验进行统计分析，p<0.05被认为差异具有统计学意义。统计软件使用SPSS11.0。 结果: 1.治疗期间出现的副反应; 志愿者平常为成形固体便或稍硬便。治疗期间未发现严重的腹泻，最常见的副作用是轻微腹泻、口苦和轻微腹痛。在三联疗法治疗期间，有10个人出现腹泻，3个人出现口苦，2个人轻微腹痛，1个人便秘。这些志愿者中有人只出现上述副反应中的一种，有人同时出现上述副反应的两种或两种以上。治疗期间未有人中断治疗。 2.根据16S rDNA克隆文库分析肠道菌群; 随机挑选的2400个克隆子的经RDP和GenBank数据库比对共检测到39种细菌种属。治疗前粪便优势菌属有Bacteroides spp.，Lachnospiraceae Incertae Sedis，Peptostreptococcaceae Incertae Sedis，Ruminococcus spp.，Parabacteroides spp.，Faecalibacterium spp.，Escherichia coli，Roseburia spp.，Alistipes spp.，and Streptococcus spp.。治疗结束后粪便中主要菌属有Bacteroides spp.，Shigella spp.，Lachnospiraceae Incertae Sedis，Parabacteroides spp.，Escherichia coli.，Klebsiella peneumoniae，Faecalibacterium spp.，Citrobacter spp.，Peptostreptococcaceae Incertae Sedis and Ruminococcus spp。本研究中未检测到Bifidobacterium spp.，Lactobacillus spp.，andyeast。与治疗前相比，治疗后专性厌氧菌明显下降（X2=51.040，p=0.000），而兼性厌氧菌（X2=190.678，p=0.000）及需氧菌（X2=18.182，p=0.000）则明显增加。与治疗前相比，治疗后正常菌群的数量明显受到抑制（X2=83.619，p=0.000），而机会致病菌的数量如E coli and K. pneumoniae明显增加（X2=124.101，p=0.000），致病菌如Shigella于治疗后明显增加（X2=468.127，p=0.000）。志愿者F于治疗后出现Campylobacter jejuni致病菌，治疗前未检测到该致病菌。 结论: 根除H.pylori感染的三联疗法可以对12名中国志愿者的肠道菌群产生负面影响，这主要是因为肠道正常菌群的生态平衡被打破从而导致机会致病菌和致病菌过度生长使肠道抗定植力减弱。在临床实践中进行以抗生素为基础的根除H.pylori感染治疗时应该考虑到这方面的问题。本研究成功构建了根除HP治疗前后肠道菌群的16S rRNA基因克隆文库。通过16S rRNA序列分析技术，我们能够直接使用临床标本，不需要获得纯培养的细菌，能够快速检测和鉴定不能培养的细菌，鉴定使用常规方法难以鉴定的细菌和发现新的病原菌。16S rRNA序列分析技术可用于临床和环境中微生物的检测及鉴定，并能够较好的反映菌群的数量及多样性。我们的研究没有进一步证据证明抗生素根除H.pylori感染后对肠道微生态的长期影响，但是已有研究显示根除H.pylori感染治疗后35天左右受到抑制的肠道菌群回复正常。未来的研究应该关注目前的治疗方法是否将导致肠道菌群抗定植模式的长期改变。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

实验材料

实验方法

结果

讨论

全文小结

参考文献

附录 中英文缩略词对照表

综述16S rRNA基因文库在肠道菌群研究中的应用

在读期间撰写论文情况

致谢

统计学证明