海藻糖合成酶制备及其催化麦芽糖生产海藻糖研究

摘要

海藻糖作为新型糖类，是一种非常独特的非还原性二糖，不仅理化性质比较稳定，还具有非特异性保护生物大分子免受恶劣条件伤害的功能。近些年这种新型糖类的生产和应用研究一直是热点。目前，酶转化法在海藻糖众多的制备方法中独树一帜，其中单酶法（海藻糖合成酶法）的优势更加突出，能够催化麦芽糖一步转化为海藻糖，反应简单、原料价格低廉、副产物少、催化专一性强，符合工业生产注重低成本高收益的目标，是一种较为理想的海藻糖生产方法。本文主要研究海藻糖合成酶的制备方法以及酶催化生产海藻糖的工艺。
　　利用现代生物信息学手段对已知的灰色链霉菌来源的海藻糖合成酶基因序列进行了优化改进，并成功构建基因工程菌pET28a(+)-BL21(DE3)。对工程菌摇瓶培养条件进行研究发现，接种量5％的基因工程菌在37℃，pH7.5条件下以200 r/min转速进行培养时可以获得最佳产酶效果;通过乳糖和IPTG两种不同的诱导剂分别对工程菌进行诱导表达，得到其产酶的最适诱导条件:在菌体OD600生长至约0.6时添加终浓度为0.5 mmol/L的诱导剂，25℃低温诱导20h。比较两种诱导剂发现，乳糖的诱导效果要略微高于IPTG，而且无毒无害，成本低廉，可以替代IPTG作为工程菌产酶的诱导剂。
　　采用单因素和响应面实验对工程菌培养基配方进行优化，确定了基础培养基配方:胰蛋白胨9.0 g/L，酵母粉14.6 g/L，MgSO46.0 g/L，微量元素3.0 mL/L。并通过玉米浆替代胰蛋白胨和酵母粉作为培养基的主要成分，得到玉米浆培养基的配方为:玉米浆26.0 g/L，MgSO42.1 g/L，微量元素7.0 mL/L。经过实验证明了廉价玉米浆作为工程菌培养基主要成分的可行性。
　　对重组海藻糖合成酶酶学性质和催化条件研究发现，重组酶的最适pH为7.5，在pH7.0～8.0处理1h后可以保持90％以上的酶活稳定性;最适温度是35℃，在40℃以下具有较好的热稳定性，当温度达到60℃时，酶蛋白完全变性失活;5mmol/L的K+和Na+能够促进酶活力;5 mmol/L的Mn2+、Ca2+、Co2+、Fe2+、zn2+和Cu2+能不同程度抑制重组酶酶活力，其中Zn2+和Cu2+完全抑制酶活性。通过单因素试验和L9(34)正交试验对重组酶催化条件优化得到，海藻糖达到最大转化率的反应条件:pH=7.5、温度35℃、加酶量1∶20(v/v)、反应时间9h。最佳条件下海藻糖转化率可以达到69.6％。
　　对海藻糖的分离提纯工艺进行研究得到，最佳的糖化条件:糖化酶添加量0.2％(v/v)，pH为4.5，温度60℃，糖化12h。最佳的脱色条件:颗粒活性炭添加量0.3％(w/v)，pH为4.5，温度80℃，脱色1h。经过阴阳离子交换树脂连续脱盐之后进行浓缩和结晶，最后得到纯度为98.5％的海藻糖结晶。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 海藻糖的发现

1．2 海藻糖的理化特性

1．3 海藻糖的生产制备方法

1．3．1 微生物提取法

1．3．2 微生物发酵法

1．3．3 化学合成法

1．3．4 酶转化法

1．3．5 基因工程法

1．4 海藻糖的应用研究

1．4．1 海藻糖在食品行业中的应用研究

1．4．2 海藻糖在生物医药方面的应用研究

1．4．3 海藻糖在日用化工方面的应用研究

1．4．4 海藻糖在农业方面的应用研究

1．5 课题的研究目的及意义

1．6 课题研究内容

第二章 海藻糖合成酶基因工程菌的培养与表达

2．1 实验材料

2．1．1 优化设计基因序列

2．1．2 菌种

2．1．3 主要实验仪器

2．1．4 主要实验试剂

2．1．5 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 摇瓶培养方法

2．2．2 粗酶液的制备

2．2．3 重组表达产物的定性分析

2．2．4 海藻糖合成酶酶活的测定

2．2．5 菌体生长曲线的测定

2．2．6 工程菌培养条件研究

2．2．7 工程菌诱导条件研究

2．3 实验结果与分析

2．3．2 工程菌的生长曲线

2．3．3 工程菌培养条件研究

2．3．4 工程菌诱导条件研究

2．4 本章小结

第三章 海藻糖合成酶基因工程菌培养基配方优化

3．1 实验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 原料和培养基

3．1．3 主要实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 摇瓶培养方法

3．2．2 粗酶液的制备

3．2．3 酶活力测定方法

3．2．4 基础培养基的配方优化

3．2．5 玉米浆培养基的配方优化

3．3 结果与讨论

3．3．1 基础培养基的配方优化

3．3．2 玉米培养基的配方优化

3．4 本章小结

第四章 海藻糖合成酶酶学性质及催化条件的研究

4．1 实验材料

4．1．1 菌株

4．1．2 原料和培养基

4．1．3 主要实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 摇瓶培养方法

4．2．2 粗酶液的制备

4．2．3 酶活力测定方法

4．2．4 海藻糖转化率测定方法

4．2．5 重组酶酶学性质的研究

4．2．6 酶催化条件的研究

4．3 实验结果与分析

4．3．1 葡萄糖、麦芽糖和海藻糖标准曲线的绘制

4．3．2 重组酶催化反应液的HPLC分析

4．3．3 重组酶酶学性质

4．3．4 重组酶催化反应条件的研究

4．4 本章小结

第五章 海藻糖分离提纯工艺的研究

5．1 实验材料

5．1．1 原料

5．2．2 主要实验仪器

5．2．3 主要实验试剂

5．2 实验方法

5．2．1 糖化

5．2．2 脱色

5．2．3 脱盐

5．2．4 浓缩

5．2．5 结晶

5．3 实验结果

5．3．1 糖化处理结果

5．3．2 脱色处理结果

5．3．3 脱盐处理结果

5．4．4 浓缩处理结果

5．4．5 结晶处理结果

5．4 本章小结

第六章 论文主要结论与展望

6．1 论文的主要结论

6．2 论文的创新点

6．3 展望

参考文献

致谢

附录