定点突变鉴定Myxococcus sp.V11麦芽糖基海藻糖水解酶MTHase的催化中心

摘要

[目的]麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)是一种水解与α-1,1糖苷键相邻的α-1,4糖苷键,生成麦芽寡糖和海藻糖,是以淀粉为底物生产海藻糖工艺中的关键酶.实验室从菌株Myxococcus sp.V11基因组中克隆到麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因并异源表达,通过氨基酸序列分析和三维建模,推测其可能的催化中心氨基酸残基构成.[方法]通过对MTHase上可能存在的3个活性位点D256、E291、D386进行PCR介导定点突变,分别将其突变成为D256A、E291A和D386A.[结果]系统进化树结果表明Myxococcus sp.V11所产MTHase与已报道的Deinococcus radiodurans所产麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolase,DR0464)相似度最高,但仅为49.23％,与已报道的淀粉酶相似度则有较大差异.氨基酸序列比对结果表明MTHase与其它来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶都具有相同的保守序列:GTFTPEG(113-119)、WGYDG(153-157)、ED(291-292)、GLXVXLDXVXNHXGPXGNY(184-202)、DGXRXDA(251-257)、IQNHDQ(382-387).三联体活性中心(Asp256-Glu291-Asp386)均位于保守区域之内,其中Asp256是亲核试剂,Glu291是酸碱催化的质子供体,Asp386起着维持Glu291稳定构象的作用.以已解析的相似性最高的麦芽寡糖基海藻糖水解酶(PDB ID:2BHU)为模板,在SWISS-MODEL上通过同源建模得到MTHase的三维结构模型.MTHase与2BHU虽然相似性仅为49％,但都具有一个典型GH13家族糖苷水解酶所共有的(α/β)8桶状结构域.三维结构显示MTHase主要由3个结构域构成:催化结构域Domain A(Ala95-Asp316,Gln372-Ser512)形成一个典型的(α/β)8桶状结构,Domain A的中间形成一个裂口,活性中心位于口袋之内;N端结构域(Domain B)主要为β-折叠结构,Domain C也由β-折叠构成,催化三联体Asp256-Glu291-Asp386位于靠近Domain C的位置.MTHase与底物连接的氨基酸残基Gly197,Pro198,Gly200,Asn201,Tyr202,Trp210,Asp316,Asp317,His320,Tyr337,Arg366,Asn390均与2BHU一致.通过定点突变,重组表达和活力测定,结果显示突变子D256A、E291A和D386A均彻底失去了淀粉酶活性.[结论]MTHase的活性中心由D256、E291和D386构成,与底物结合的氨基酸位点决定了其对不同底物的适应性.