组氨酸标签木聚糖酶的构建表达和酶特性鉴定

摘要

半纤维素（hemicollulose）与纤维素、木质素共同组成植物细胞壁的三大主要成分，木聚糖是半纤维素中的最主要成分。木聚糖酶（endo-1,4-xylanase,EC3.2.1.8）是糖苷水解酶家族的成员，可以水解纤维素的主要成分——木聚糖。近几十年来，木聚糖酶广泛应用在工业生产中，包括纺织、食品、饲料、造纸和纸浆工业。同时有研究报道，这类酶在生物降解和生物转化农业废弃物和副产品方面有广阔的前景。根据氨基酸序列的相似程度以及核心催化区域的结构特点，木聚糖酶被分入糖苷水解酶第10和第11家族。第11家族木聚糖酶具有较小的分子质量，在结构上高度相似，并且有相似的木聚糖底物特异性。
　　11家族耐热木聚糖1YNA分离自嗜热真菌Thermomyces lanuginosus DSM10635，在Escherichia coli.BL21（DE3）中表达。为提高其稳定性，利用PCR手段，在其N末端添加了一个二硫键Q1C-Q24C。得到重组酶DSB在pH6.5环境下最适反应温度提高了10℃，达到了75℃。
　　为简化DSB纯化方式，本研究以木聚糖酶DSB基因为模板，利用PCR去除其终止密码子后插入表达载体pET-22b（+），得到C末端添加多聚组氨酸标签（His·Tag）的木聚糖酶表达载体，构建基因命名为dsb-his，并利用大肠杆菌表达。
　　表达产物经Ni Sepharose亲和层析纯化，得到电泳纯的酶。酶蛋白的大小，酶特性没有受到组氨酸标签的影响。蛋白纯化操作得到了简化。
　　虽然组氨酸标签在蛋白纯化方面应用广泛，其对酶特性的影响还没有系统的研究和总结。结合11家族木聚糖酶的3D结构分析，分析是因为C末端在酶蛋白表面且组氨酸标签较小，形成无规则卷曲。本研究说明组氨酸标签木聚糖酶的生化特性和原始酶没有差异，提供了高效纯化相应木聚糖酶的方法，为相关小分子酶蛋白的纯化提供了更简便的操作途径。

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第1章 绪 论

1.1 纤维素和半纤维素

1.2 糖苷水解酶研究综述

1.3 木聚糖酶研究进展

1.4 蛋白质稳定性研究进展

1.5 大肠杆菌表达系统

1.6 研究意义

第2章 组氨酸标签载体的构建及表达

2.1 实验材料

2.2 组氨酸标签木聚糖酶载体的构建

2.4 结果与分析

2.5 小结

第3章 组氨酸标签木聚糖酶的纯化

3.1 实验材料

3.2 发酵重组木聚糖酶

3.3 重组木聚糖酶液的收集和粗提纯

3.4 Ni柱纯化重组木聚糖酶

3.5 超滤管浓缩纯化酶液

3.6 SDS-PAGE检验纯化重组木聚糖酶

3.7 结果与分析

3.8 小结

第4章 组氨酸标签木聚糖酶的酶特性测定

4.1 实验材料

4.2 酶的表达

4.3 酶特性测定

4.3 结果分析

4.4 小结

结论

参考文献

致谢

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附录B 硫酸铵饱和度常用表