基于靶酶结构的新型抑制剂先导化合物的合理设计与筛选研究

摘要

药物(含农药)研发过程中最关键的步骤之一就是尽可能地发现或设计作用靶标(酶)抑制剂的先导结构。随着理论与计算化学、分子病理生物学、分子和结构生物学、药物化学和分子药理学等学科的不断发展，越来越多的抑制荆作用分子机制得以阐明，相应作用靶标(酶)的结构及其活性中心与配体分子间相互作用的信息也逐渐清晰。目前，发现或设计靶酶抑制剂先导结构已经从传统的随机筛选发展到在有效的分子模拟指导下针对靶酶结构特征进行合理设计的后基因组时代。由于在分子水平上认知受体——配体相互作用的详细机理能够有效地提高新型高效抑制剂先导结构合理设计和筛选研究的速度和准确度，因此，分子水平上认知受体——配体相互作用的详细机理往往是研发靶酶抑制剂过程中最重要的科学问题。目前主要是通过各种现代分子模拟、基因工程、光谱表征和有机(固相)合成等技术交叉集成来研究和阐明靶酶活性中心与底物、特别是配体(抑制剂)分子间相互作用的详细机理。 本论文综合运用了各种现代分子模拟、基因工程以及光谱表征等技术系统地研究真核中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(Class-I HMGR)、原核中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(Class—II HMGR)、农作物真菌中羊毛甾醇14α-脱甲基化酶(CYP51)等靶酶抑制剂和靶酶活性中心的结构信息以及作用位点与配体(抑制剂)分子间相互作用的详细机理。在此基础上，进行了基于上述靶酶结构新高效抑制剂先导结构的合理设计与筛选研究。具体研究内容如下： 第一章，简单介绍了计算机辅助药物设计常用方法和原理，对人体肝脏细胞中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(Class-I HMGR)系、原核中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(Class-II HMGR)系，以及真菌中羊毛甾醇14α-脱甲基化酶(CYP51)系的性质、功能及其研究进展、意义进行了详细介绍，同时对各个酶系的抑制剂研究进展进行了总结介绍。 第二章，以人体肝脏细胞中HMGR作为Class-I HMGR酶系的代表为研究对象，对已知的他汀类抑制剂进行了基于点叠合(Atom—fit)和以药物分子对接在活性空腔的结合构象为它们的空间叠合方式(Dock-fit)的两种叠合方式的3D—QSAR研究，并获得了具有较高精度的Models-dock预测模型。根据已知的他汀类抑制剂的结构与活性信息构建Tuplets药效团模型，利用复合物品体结构中他汀类抑制剂与受体活性空腔的相互作用信息，以及将前面获得的3D-QSAR模型作为一个评价模型进行了基于结构的虚拟筛选研究，筛选出30个结构新颖的候选化合物，用于体外微粒体水平上的HMGR酶抑制活性测试。 第三章，以肺炎链球菌中HMGR(SP-HMGR)作为Class-lI HMGR酶系的代表为研究对象，在计算理论模拟方面，利用假单胞菌中的HMGR晶体结构(PDB code：1T02)为模板构建了SP-HMGR的空间理论三维结构，并进行了分子动力学模拟研究；基于模建得到的SP-HMGR理论模型进行分子对接、分子碎片轨道理论(fragment molecular orbital，FMO)能量计算研究，得到可靠的对接程序方法和活性空腔的重要残基信息；根据前两步的研究信息，针对SP-HMGR活性空腔进行基于受体结构的虚拟筛选研究，并将FMO计算作为虚拟筛选的一个评价模型，最终确定30个候选化合物进行下一步的活性测试研究。生物活性测试实验方面，首先从肺炎链球菌中提取HMGR基因进行克隆、表达和功能研究；利用紫外吸收分光光度法，通过检测反应物NADPH在340nm处的吸收峰的变化来反应底物消耗的原理建立了离体酶水平的生物活性测试方法，对理论计算中筛选的化合物进行酶体水平的活性测试，初步实验结果显示通过理论与实验相结合的筛选，获得了一个比己知的lovastatin抑制剂对SP-HMGR抑制活性更高的、结构新颖的苗头化合物，此化合物可以作为先导化合物进行进一步的优化设计研究。 第四章，分别以稻瘟菌的羊毛甾醇14α-脱甲基化酶(MG-CYP51)、柑桔绿霉菌的羊毛甾醇14α-脱甲基化酶(PD-CYP51)为研究对象，根据P450家族酶系蛋白氨基酸-级序列同源性不高、空间二维、三维结构性质较保守的特点，利用CPHmodels方法分别构建出了较可靠的MG-CYP51、PD—CYP51的空间三维结构模型，再根据蛋白活性空腔的疏水性较强的特性，采用与之相对应的组合对接和打分程序方法(Flex-Pharm/PMF/GOLD，FlexX/PMF/GOLD)，以及已有抑制剂的作用机制信息，针对两个体系我们分别筛选出19和27个候选抑制剂苗头化合物。根据各自的酶体和菌体水平的活性测试结果显示，候选苗头化合物中有多个化合物都具有很好的抑制活性，可以作为很好的先导化合物米进一步研究。整个研究结果显示：通过上述的同源模建、分子对接、虚拟筛选的整套计算流程能够以较高命中率筛选出较好的苗头化合物，说明了整个计算流程的可靠性和准确性。

目录

文摘

英文文摘

声明

本论文主要创新点

第一章文献综述

$1.1引言

$1.2计算机辅助药物分子设计

1.2.1计算机辅助药物分子设计常用方法

$1.3 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA Reductase，HMGR)性质、功能及研究进展

1.3.1 Class-Ⅰ HMGR

1.3.2 Class-Ⅱ HMGR

$1.4细胞色素P450羊毛甾醇14α-脱甲基化酶(CYP51)研究意义与进展

1.4.1 CYP51的性质、功能

1.4.2 CYP51抑制剂作用机制及CYP51与抑制剂复合物的晶体结构

1.4.3 CYP51抑制剂研究进展

参考文献

第二章人体中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)抑制剂的3D-QSAR研究及其抑制剂先导化合物的筛选

$2.1前言

$2.2他汀类抑制剂的3D-QSAR研究

2.2.1研究体系与计算方法

2.2.2结果与讨论

$2.3基于受体、配体结构信息的虚拟筛选研究

2.3.1 Class-Ⅰ HMGR虚拟筛选研究

$2.4本章小结

参考文献

第三章肺炎链球菌中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(SP-HMGR)新型抑制剂先导化合物的筛选研究

$3.1前言

$3.2肺炎链球菌中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(SP-HMGR)分子动力学及其与小分子化合物的相互作用研究

3.2.1采用的计算理论方法

3.2.2结果与讨论

$3.3 Class-Ⅱ HMGR新型抑制剂的虚拟筛选

3.3.1前言

3.3.2基于受体SP-HMGR蛋白结构的虚拟筛选

$3.4肺炎链球菌中HMGR基因克隆、表达、纯化以及苗头化合物的活性测试研究

3.4.1材料与方法

3.4.2结果与讨论

$3.5本章小结

参考文献

第四章柑桔绿霉菌、稻瘟菌中P450－CYP51新型抑制剂先导化合物的筛选

$4.1前言

$4.2 PD-CYP51、MG-CYP51的同源模建及分子动力学研究

4.2.1研究方法

4.2.2结果与讨论

$4.3基于受体、配体结构信息的虚拟筛选研究

4.3.1虚拟筛选方法流程

4.3.2.结果与讨论

$4.4活性测试

4.4.1稻瘟菌、柑桔绿霉菌中CYP51基因克隆与表达

4.4.2化合物与靶酶结合能力的光谱分析方法

4.4.3化合物对稻瘟菌、柑桔绿霉菌生长抑制的测试方法

4.4.4实验结果与分析

$4.5本章小结

参考文献

全文总结

附录

攻读学位期间主要的研究论文

致谢