基于多酚氧化酶靶酶结构的新型抑制剂先导化合物的合理设计与筛选

摘要

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是一种由核编码的结构复杂的含铜的氧化还原金属酶，催化酚类物质的氧化，一种以Cu2+为辅基的氧化还原酶。在自然界中广泛存在于植物、人体、动物、微生物等各种生物体中。PPO是引起果蔬褐变的重要的酶之一，果蔬的褐变引起了很大的经济损失。因此，高效新型的PPO抑制剂的开发具有重要的意义。
　　伴随着计算机辅助药物设计、分子生物学和酶学等多领域的迅速发展，合理的药物分子设计已成为新药研发的重要途径。在本研究中，我们根据PPO结构特点，综合运用计算机辅助药物设计、生物活性测定及有机合成等技术对其新型抑制剂先导化合物进行虚拟筛选与合理设计、化学合成、生物活性测定。具体研究内容如下:
　　一、先导化合物的虚拟筛选方面:首先，由于藕的PPO目前晶体结构未解析出来，我们采用甘薯PPO为模板，通过SWISS-MODEL同源模建得到藕的PPO蛋白的三维结构。然后根据已知抑制剂与已报道的PPO酶结构之间的结合模式和作用机制为模板，分析确定了Suflex-Dock和GOLD-Wizard两种对接方法来进行基于藕中PPO靶酶结构的虚拟筛选。根据配体小分子与蛋白质的结合构象及结合力，从7万多个商业化的小分子数据库中筛选出24个潜在活性的化合物，通过Specs公司购买这24个候选化合物，并进行下一步的生物活性测定研究。
　　二、生物活性测定方面:利用紫外吸收分光光度计，通过测定410nm处的吸光度值来测定PPO的生物活性。对筛选得到的24个候选化合物进行了酶体水平的生物活性测定。实验结果表明，18号化合物对PPO的活性抑制能力最强，其IC50值达到了0.14mg/mL，与已商品化的PPO抑制剂抗坏血酸的IC50值相当(抗坏血酸为0.12mg/mL)，且18号化合物对接构象及作用机制与参照结构（苯基硫脲）类似。因此，我们将18号化合物作为先导化合物应用于进一步的结构优化设计研究。
　　三、先导化合物的优化设计方面:根据PPO活性位点与抑制剂之间的作用机制，结合参照结构的分子结构特点，对18号化合物的结构进行合理的优化设计，最终确定优化后的目标结构为.-N-取代苯基-取代酰肼氨基硫脲。采用一锅法合成21个目标化合物，并进行了IR、1H NMR结构表征。利用同样的生物活性测定方法，对得到的目标化合物进行生物活性测定。实验结果表明，A2的生物活性最高，其IC50值为0.015mg/mL，与先导化合物相比，抑制率增加了89.29％。
　　四、定量构效关系方面:对合成的21个目标化合物的结构与其PPO活性数据之间进行定量构效关系研究，得到一个相关性显著的3D-QSAR模型:q2=0.607，r2=0.997，N=2，SEE=0.045，F=304.588。模型显示:在R2取代基上引入体积较大的基团，有利于活性的提高;在R1取代基引入含极性原子的基团有利于活性的提高。该模型为进一步的结构的优化设计提供了理论依据。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 抗氧化剂的作用及使用范围

1．2 多酚氧化酶(PPO)的研究进展

1．2．1 PPO晶体结构分析

1．2．2 PPO作用机制

1．3 PPO抑制剂研究进展

1．3．1 PPO抑制剂的种类

1．3．2 PPO抑制剂的作用机制

1．4 计算机辅助药物设计

1．4．1 同源模建

1．4．2 基于配体结构的药物分子设计

1．4．3 基于受体结构的药物分子设计

1．5 选题的目的及意义

第二章 新型PPO抑制剂先导化合物的筛选研究

2．1 同源模建

2．1．1 目标序列与模板序列确定

2．1．2 目标序列与模板比对

2．1．3 同源模建及结果

2．1．4 模建结果的评价

2．2 虚拟筛选

2．2．1 数据库的准备

2．2．2 空间三维结构及催化作用机制分析

2．2．3 虚拟筛选方法与参数设定

2．2．4 虚拟筛选流程

2．2．5 结果与讨论

2．3 筛选出的候选化合物的生物活性测定

2．3．1 试剂和仪器

2．3．2 实验方法

2．3．3 结果与讨论

第三章 先导化合物的优化设计、合成与生物活性测定

3．1 先导化合物结构的合理设计

3．1．1 先导化合物与PPO活性位点的相互作用分析

3．1．2 结构设计

3．1．3 目标化合物的理论分析验证

3．2 目标化合物的合成

3．2．1 试剂与仪器

3．2．2 合成路线

3．2．3 N-取代苯基-取代酰肼氨基硫脲类化合物制备与表征

3．2．4 结果与讨论

3．3 优化合成的目标化合物的生物活性测定

3．3．1 实验方法

3．3．2 结果与讨论

3．4 目标化合物与PPO酶活性抑制定量构效关系(3D-QSAR)分析

3．4．1 实验材料与方法

3．4．2 CoMFA模型的建立

3．4．3 结果与讨论

第四章 总结与展望

4．1 总结

4．2 展望

参考文献

附图

硕士期间发表的论文

致谢