苦瓜中降血糖活性成分的高通量筛选研究

摘要

本论文应用基于反式激活原理的细胞水平PPAR激动剂高通量筛选(HighThroughputScreening，HTS)模型，从苦瓜中筛选活性部位与活性成分，同时对其进行化学研究。 1.苦瓜中PPAR激动剂的高通量筛选研究。首次运用PPAR三种亚型为靶点的高通量筛选模型，对苦瓜的提取物和提取物的分离纯化产物进行活性筛选。结果表明： (1)5种不同的苦瓜提取物组分(MC1、MC2、MC3、MC4、MC5)对PPARα均无激活作用。MC3对PPARδ和PPARγ具有较强的激活效果，其激活倍数分别达1.995、1.689。 (2)多糖MC3-2和MC3-4样品对PPARγ受体有激活作用。其中，MC3-2对PPARγ受体的激活作用更强。MC3-2的SephadexG-100分离产物中，多糖MC3-2-1和MC3-2-2样品都能激活PPARγ受体，其中MC3-2-2对PPARγ受体的激活作用更强些。 (3)MC2-3组分能较强地激活PPARα、γ、δ受体，其激活倍数分别为1.7607、3.7730、1.7846。MC2-2组分对PPARδ受体的激活作用较弱。其中MC2-3组分的PPARδ活性明显高于对照药物2-Bro-(5uM)。 (4)苦瓜苷(Charantin)能较强地激活PPARα、δ、γ受体，其激活倍数分别为1.7218、1.7797、1.6818，是PPAR的三效激动剂。 MC3、MC2-3和Charantin将成为苦瓜降脂、降糖、减肥作用的主要活性因子。 2.苦瓜多糖的分离、纯化与化学研究。采用DEAE-52纤维素柱色谱和SephadexG-100凝胶柱色谱对MC3进行分离纯化研究。MC3经DE-52分离得到5组分，其中MC3-2和MC3-4是活性成分。MC3-2再经凝胶过滤色谱分离得到多糖MC3-2-1和MC3-2-2，其平均相对分子质量经HPLC测定，分别为8.4×104和1.7×104；经TFA水解后得到的糖腈乙酸酯衍生物，气相色谱检测表明MC3-2-1和MC3-2-2是一种杂多糖，其鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖分别为11.90∶26.39∶0∶2.50∶1∶1.67和3.52∶2.84∶0.26∶1.01∶0.75；IR、高碘酸氧化和Smith降解研究表明，多糖MC3-2-1和MC3-2-2是一种不含糖醛酸的中性杂多糖，单糖残基是以吡喃型存在，以α，1→6、α，1→2或α，1→4糖苷键连接的多糖；分子中无α，1→3糖苷键；多糖经UV扫描均不见蛋白和核酸的吸收峰。 3.水溶性苦瓜多糖提取工艺的研究。通过正交试验确定了水溶性苦瓜多糖的最佳提取条件：：浸提温度90℃，浸提时间为2h，固液比1∶20，乙醇沉淀浓度为85﹪。苦瓜干粉样品中水溶性苦瓜多糖含量为8.20﹪。 4.改良苯酚-硫酸法测定苦瓜多糖研究。采用改良的苯酚-硫酸法测定苦瓜及其提取物中多糖的含量，以单糖组成比例组合而成的混合单糖为对照品制作糖的标准曲线，从而消除了用葡萄糖做标准引起的系统误差，吸光度的变化与多糖含量呈线性关系，糖浓度在20～100μg范围内线性较好，平均回收率达100.68﹪，其供试液在2h内显色稳定。 5.苦瓜中胡萝卜苷的分析、提取和富集研究。以硅胶G60为固定相、氯仿-乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸-水-吡啶(3∶6∶6∶1∶0.9∶0.1，v/v)为展开剂，上行展开5cm，2﹪高氯酸为显色剂，建立了苦瓜中胡萝卜苷的HPTLC分析方法。在该条件下，苦瓜胡萝卜苷的Rf值为0.70，苦瓜胡萝卜苷的检测范围在200～1000ng，其斑点的面积与胡萝卜苷的检测量具有良好的线性关系(R2为0.9953)。胡萝卜苷的平均回收率达100.64﹪，方法的精密度良好(RSD＜1.5﹪)。 通过单因素试验和正交试验，采用HPTLC检测法，以胡萝卜苷为考察指标，对影响苦瓜甾苷提取效果的各因素进行了研究。结果表明，各因素对苦瓜甾苷提取效果的影响程度从高到低依次为：乙醇浓度＞固液比＞浸提时间＞浸提温度。确定了苦瓜中苦瓜甾苷的最佳提取工艺参数为：乙醇浓度80﹪，浸提温度55℃，浸提时间5h，固液比1∶10。 D101树脂可以有效富集胡萝卜苷，经乙醇分步洗脱后，浓缩回收乙醇，冷冻干燥可得MC2-3。经HPTLC分析，MC2-3中苦瓜胡萝卜苷含量达2.10﹪，胡萝卜苷的富集倍数达28。 6.苦瓜苷是PPAR模型的三效激动剂。应用硅胶柱层析技术从MC2-3中分离纯化得到苦瓜苷Charantin。苦瓜苷是PPAR的三效激动剂。应用HPTLC、IR、1HNMR、13CNMR等技术对Charantin的结构进行了确证。确证苦瓜苷是由胡萝卜苷与△5,25豆甾二烯醇葡萄糖苷组成。 运用PPAR激动剂的高通量筛选技术研究证明了苦瓜是具有降糖、降脂的生理功能。苦瓜的降糖、降脂的主要活性成分是苦瓜多糖和苦瓜苷。苦瓜多糖降糖、降脂活性可能与单糖组成、糖苷键的连接方式、分子量大小等有密切的关系。低分子量多糖降糖、降脂活性更强。而且多糖之间具有协同降糖、降脂作用。苦瓜苷的降糖、降脂作用与其结构和含量有密切关系。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章绪论

第二章苦瓜活性部位的高通量筛选

第三章苦瓜多糖的分离、纯化与活性研究

第四章苦瓜多糖的结构分析

第五章苦瓜多糖测定方法和提取工艺研究

第六章苦瓜中胡萝卜苷的HPTLC分析和提取工艺研究

第七章胡萝卜苷的富集与活性研究

全文结论

参考文献

附录

缩略词表

致谢

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