生防制剂在葡萄保鲜中的应用与抑菌机理研究

摘要

葡萄(Vitis vinifera L．)采后微生物病害会导致巨大经济损失，以往葡萄果实采后病害的防治主要采用硫处理的方法，但长期大量使用化学杀菌剂会使致病菌产生抗药性，同时会对人体健康及环境造成危害，因此迫切需要寻找一种有效而无害的防治方法。以有效微生物取代化学杀菌剂用于果蔬采后病害的防治己显示出巨大的应用前景，并成为一个新的研究热点。研究微生物杀菌剂取代化学杀菌剂进行葡萄果实采后病害的防治，对于减少葡萄果实中硫的残留，保护环境，保证食用安全性具有重要意义。 本研究从已筛选出的对葡萄果实采后病害具有拮抗作用的酵母菌中，选择抑菌效果最好的菌种制备生防制剂。对比了不同拮抗酵母抑制灰霉葡萄孢的效果以及在葡萄果实表面的生长性能。探讨了拮抗酵母的抑菌机理，研究了拮抗酵母制剂的制备方法，并摸索了提高生防制剂对葡萄果实采后病害抑制效果的措施。主要研究结果如下： 1．通过invivo试验发现：在所选的拮抗酵母中，季也蒙毕赤氏酵母抑制灰霉葡萄孢的效果最好，腐烂率为空白对照的18％左右，并且可以在新鲜葡萄果实表面快速生长，具备开发成葡萄生防制剂的潜力。 2．通过混菌培养、对比拮抗酵母各处理液抑菌效果以及检测酵母无营养培养基中β-1，3葡聚糖酶和几丁质酶的活性情况证实：季也蒙毕赤氏酵母并非通过分泌抑菌物质来发挥抑制致病菌的作用，而是通过营养与空间竞争来抑制灰霉葡萄孢。 3．普通光学显微镜和扫描电镜观察发现：季也蒙毕赤氏酵母能够吸附在灰霉葡萄孢的菌丝体上，但季也蒙毕赤氏酵母培养滤液中不含抑菌成分，季也蒙毕赤氏酵母与灰霉葡萄孢的无营养培养液中没有检测出几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶活性。上述结果均不支持重寄生的判断，从现有研究中尚未能证实季也蒙毕赤氏酵母与灰霉葡萄孢间存在寄生关系。 4．通过在葡萄果实上接种微生物，观察葡萄果实中抗病酶系(几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶)的活性变化规律，研究拮抗酵母菌对果实抗病性的诱导作用，结果表明：拮抗酵母未能显著提高葡萄果实抗病性酶系的活性，诱导果实抗性也并非季也蒙毕赤氏酵母抑制灰霉葡萄孢生长的方式。 5.通过营养源单因素筛选，结合培养基正交试验发现：在PDB培养基中加入果糖18g/L，酵母膏2.0g.L，尿素2.0g/L，L-D-L-亮氨酸0.2g/L，KH<,2>PO<,4>5.5g/L，MnSO<,4>4.5mg/L，ZnSO<,4> 25 mg/L，烟酰胺0.4mg/L，肌醇120mg/L对季也蒙毕赤氏酵母进行增值培养，可以使酵母增值明显高于普通PD8培养液，该配方可作为生产培养液配方。 6.选择接种量、培养时间、通风量、搅拌速度作为影响因素在小型发酵罐中进行中试发酵试验，结果表明：采用培养温度28℃、初始pH 4.0，接种量6％、培养时间30h，通风量2.0 V.V.m(m<'3>空气/m<'3>发酵液·min)，搅拌速度100rpm的发酵工艺对季也蒙毕赤氏酵母进行增值培养，鲜酵母产量最高。 7.选择活性干酵母常用保护剂和载体，生产季也蒙毕赤氏酵母干粉，通过测定一定贮藏期内干粉中酵母的存活率，确定最佳保护剂和载体。结果表明：选用山梨醇2％+蔗糖酯4％+PG 0.45％作为季也蒙毕赤氏酵母保护剂，奶粉作为载体制备酵母干粉制剂，可以使酵母菌存活率最高。 8.采用热风干燥、真空干燥、微波干燥、离心喷雾干燥、冷冻升华干燥等工艺生产酵母干粉，对比干燥后酵母的存活率后发现：冷冻升华干燥可以使酵母干燥后达到91.6％的存活率，最有利保持酵母制剂活性。 9.通过测定酵母干粉在贮藏期中所含酵母的存活率，发现采用本研究中选取的培养液、发酵工艺和干粉制备方法制得的活性干酵母制剂具有1年以上的有效期，将其应用于葡萄果实的贮藏，结果表明：单独使用该制剂，在使用浓度为1％，冷藏三个月后，可使葡萄果实腐烂率下降18％。 10.将各种提高葡萄果实抗病性的措施与拮抗菌结合，在葡萄果实上进行invivo试验，结果表明：NaHCO<,3>、CaCl<,2>处理，微波处理、热激处理、涂被、水杨酸(SA)诱导等措施均不能显著提高季也蒙毕赤氏酵母的抑菌能力，而低剂量的化学防腐剂，能够显著提高酵母制剂对葡萄果实采后病害的防治能力，用0.025％的富马酸二甲酯加0.3％的茉莉酸甲酯(MeJA)加1％的季也蒙毕赤氏酵母制剂处理的葡萄果实，在冷藏4个月后，腐烂率比季也蒙毕赤氏酵母制剂单独处理葡萄低48％，比硫处理腐烂率高13％，达到了实用水平。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 文献综述

1我国鲜食葡萄产业现状

2葡萄的采后病害

2.1主要病害

2.2次要病害

3葡萄采后病害防治的常用方法

3.1化学防治

3.2物理防治

4果实采后病害的生物防治技术

4.1拮抗菌的来源及筛选方法

4.2拮抗菌的抑菌机理

4.3拮抗菌抑菌的增效措施

5葡萄采后病害的生物防治

5.1拮抗菌的筛选

5.2生物防治在葡萄采后病害防治中存在的问题

6本研究的目的及意义

第二章 葡萄生防制剂拮抗茵的筛选研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验设备

1.3试验方法

1.4试验设计

1.5数据处理

2结果与分析

2.1不同酵母对抑菌效果的影响

2.2葡萄鲜果表面环境对不同酵母生长的影响

3讨论

3.1拮抗菌种类的选择与葡萄采后生物防治的关系

3.2酵母的个体差异与抑菌能力的关系

3.3病原菌与生物防治的关系

3.4贮藏温度与拮抗菌抑菌效能的关系

3.5拮抗菌使用浓度与抑菌效能的关系

第三章 季也蒙毕赤氏酵母抑菌机理研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.2主要仪器设备

1.3试验样品的制备

1.4试验设计

1.5测定方法

1.6数据处理

2结果与分析

2.1 PDA混菌培养对拮抗菌和病原菌生长的影响

2.2改良察氏培养基混菌培养对拮抗酵母抑菌的影响

2.3拮抗酵母各处理液对抑菌效果的影响

2.4重寄生作用对病原菌生长的影响

2.5无营养培养对拮抗酵母分泌胞外水解酶的影响

2.6拮抗酵母对果实抗病性酶活性的影响

3讨论

3.1营养及空间竞争与季也蒙毕赤氏酵母抑菌作用的关系

3.2重寄生作用与季也蒙毕赤氏酵母抑菌作用的关系

3.3诱导果实抗性与季也蒙毕赤氏酵母抑菌作用的关系

第四章 葡萄生防制剂的制备研究

1材料与方法

1.1试验原辅材料

1.2培养基配方

1.3主要药品

1.4主要仪器设备

1.5试验设计

1.6分析测定方法

1.7数据处理

2结果与分析

2.1季也蒙毕赤氏酵母培养液的研制

2.2季也蒙毕赤氏酵母培养条件的研究

2.3季也蒙毕赤氏酵母生防制剂的研制

2.4季也蒙毕赤氏酵母制剂品质及性能测试结果

3讨论

3.1培养液与季也蒙毕赤氏酵母增殖培养的关系

3.2保护剂和载体与季也蒙毕赤氏酵母制剂活性保存的关系

3.3季也蒙毕赤氏酵母制剂的使用量与效果的关系

第五章 增强生防制剂效果的研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验药剂

1.3试验仪器

1.4培养基制备

1.5试验设计

1.6数据分析

2结果与分析

2.1不同化学防腐剂对致病菌的影响

2.2不同化学防腐剂对拮抗菌的影响

2.3拮抗酵母与化学防腐剂结合对生防效果的影响

2.4金属盐类对拮抗酵母抑菌效果的影响

2.5水杨酸(SA)对拮抗酵母抑菌效果的影响

2.6茉莉酸甲酯(MeJA)对拮抗酵母抑菌效果的影响

2.7紫外线(UV-C)处理对拮抗酵母抑菌效果的影响

2.8热激处理对拮抗酵母抑菌效果的影响

2.9微波处理对拮抗酵母抑菌效果的影响

2.10涂被处理对拮抗酵母抑菌效果的影响

2.11增效措施对葡萄鲜果生物防治效果的影响

3讨论

3.1化学增效因子与季也蒙毕赤氏酵母生防效果的关系

3.2物理增效因子与季也蒙毕赤氏酵母生防效果的关系

结论

论文创新点

下一步工作设想

参考文献

附录

致谢

作者简历