柑橘速衰病毒的遗传多样性研究

摘要

由柑橘速衰病毒(CTV)引发的柑桔速衰病是全世界柑桔生产中破坏力最强、经济意义最为重要的病害之一。它主要危害以酸橙作砧木的柑桔，也能引起葡萄柚和某些甜橙品种的茎陷和果实变小等症状。本研究应用RT-PCR、单链构象多态性(SSCP)、DNA测序和系统发育分析等方法，目的是要调查我国柑橘CTV感染的基本情况，比较不同分离物的序列特征，探索CTV的系统进化关系，最终为开发分子标记鉴定我国CTV株系提供理论指导。结果如下： 1．以随机采样的方式，从湖北、湖南和江西3省10县的柑橘产区收集242份温州蜜柑、橘、甜橙和柚样品。对PAS-ELISA法检测呈阳性的样品进行CTV的CP基因的RT-PCR扩增，结果来自14个样品采集地的120份样品感染了CTV，单个采样点的感染率为20.0％-71.4％，总感染率达49.6％，表明CTV在这些地区已经广泛分布。SSCP分析显示，120份CP基因的RT-PCR扩增产物共产生120种SSCP谱型，每一种谱型含有2-7条不等的单链DNA带，暗示这些样品采集地区存在广泛的CTV混合感染。以CTAB-LiCl法制备的总RNA为模板，可以对柑橘进行CTV的RT-PCR检测。 该法制备总RNA的过程简单，成本低廉。 2．以柑橘叶片总RNA为模板，用RT-PCR扩增CP基因，扩增产物经克隆与测序证实，来自湖南道县和江西崇义3份橘的实生苗样品(HN、JX-1和JX-2)都感染了CTV。通过扩增产物克隆前和克隆后的PCR-SSCP分析，发现来自HN和Jx-1的CP基因各自只含有1种独特的序列，来自JX-2的序列则含有2种主要的序列。这表明来自3份样品的CTV的CP基因不仅存在序列变异，而且样品JX-2的CTV群体可能因为混合感染而呈异质性。 通过双向测序和序列分析，4个CP基因序列都没有碱基插入、缺失或终止密码子插入，含有完整的翻译区。核苷酸序列比对分析表明，4个克隆之间的相似性为93％-98％；克隆HN-K与葡萄牙分离物28C、以色列茎陷分离物VT的相似性都达到98％；克隆JX-1-1与印度茎馅分离物Pune和Bangalore的相似性都在98％以上；克隆JX-2-7、JX-2-17与日本苗黄分离物NUagA和美国加利福尼亚严重茎陷分离物SY568的相似性也在97％-98％之间。4个克隆与佛罗里达速衰分离物T36、弱毒分离物T30和西班牙弱毒分离物T385的相似性仅有91％-93％。系统树分析显示，4个中国克隆分属3个不同的分支，每个分支由中国克隆和地理来源不同的茎陷或苗黄分离物组成。 3．以SSCP分析显示CTV混合感染程度较轻的江西省于都县的1份甜橙样品为材料 ，通过RT-PCR扩增CP基因、p23基因和RdRp 5＇端序列。重组质粒的PCR产物的SSCP分析结果显示，CP基因、p23基因和RdRp5＇端序列都只产牛3-4种不同的SSCP带型，优势带型所对应的重组质粒所占比例基本一致。代表2种不同带型的CP基因克隆ML-12和ML-13经过测序、序列比对和进化分析，证实江西于都甜橙的CTV群体是一个至少包含有强毒(茎陷或苗黄)和弱毒2种株系的混合群体。CP基因克隆ML-12和6个强毒分离物如NUagA、SY568和T318A等茎陷或苗黄分离物具有很高的同源性，最大遗传距离仅有0.073。另一个克隆ML-13与弱毒分离物T385和T30之间只有7个核苷酸和2个氨基酸的差异。p23基因克隆ML-4与5个弱毒分离物之间的核苷酸距离为0.049-0.064。各个克隆或分离物的842bp的RdRp基因5＇端序列之间存在极大的变异性，核苷酸距离最大值高达0.221，而且遗传距离的大小与它们的生物学特性没有相关性。另外，在这段序列的中部，发现一段长17nt、富含AT的保守序列。序列比对结果表明，除了RdRp基因5＇端序列的变异性太大外，广泛分布于CP基因和p23基因的保守位点与其生物学特性具有显著的一致性。CP基因可以将速衰分离物T36和非速衰分离物如弱毒分离物T30、T385以及茎陷或苗黄分离物NUagA、SY568和T318A区分开，p23基因也可以作为标记物将所有强毒分离物和所有弱毒分离物区分开。所以，CP基因和p23基因可能都适合作为分子标记来鉴定我国CTV株系分布。

目录

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摘要

缩略词表

1文献综述

2依题依据

3材料与方法

4结果与分析

5讨论

6参考文献

附录

致谢