柑橘树皮裂纹类病毒的遗传多样性及其对裂皮类病毒拮抗作用的分子机理研究

摘要

类病毒是不编码任何蛋白的单链环状小RNA分子，通过机械方式侵染植物细胞，在某些重要的经济作物上可导致严重的病害。目前为止，已经证明柑橘植物至少是8种类病毒的天然寄主,分别为柑橘裂皮类病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘曲叶类病毒（Citrus bent leaf viroid,CBLVd）、啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid,HSVd）、柑橘矮化类病毒（Citrusdwarfing viroid,CDVd）、柑橘树皮裂纹类病毒（Citrus bark cracking viroid,CBCVd）、柑橘类病毒V（Citrus viroid Ⅴ,CVd-Ⅴ）、柑橘类病毒VI（Citrus viroid Ⅵ,CVd-Ⅵ）和柑橘类病毒Ⅶ（Citrus viroid VII,CVd-Ⅶ）。其中，CEVd的特定株系可在被广泛用作砧木的枳壳（Poncirus trifoliata）和枳橙（Citrus sinensis×P.trifoliate）上引起明显的裂皮症状，并可通过嫁接等机械方式在商业果园中快速传播，对我国柑橘产业的健康发展可造成一定为害。CBCVd被认为是CEVd和HSVd的嵌合重组体，可侵染大量的柑橘种类和柑橘近属而没有明显的症状。前人通过田间症状观察证实CBCVd在枳壳砧木上对CEVd存在拮抗现象，两种类病毒复合侵染会降低CEVd在敏感砧木上的症状，但是其分子机理尚不详。“Etrog”香橼(C.medica)中的“Arizona861-S1”品系被广泛用作柑橘类病毒的指示植物，为研究柑橘类病毒间的互作机制提供了一个有利平台。目前类病毒与宿主的互作研究多集中于草本寄主，而类病毒的自然侵染报道多见于木本植物如柑橘等，木本植物与类病毒的互作研究更具生产实践价值。本研究进行了柑橘类病毒的鉴定和侵染性克隆的构建，分析了柑橘裂皮病潜在拮抗资源CBCVd的遗传多样性，之后借助下一代测序技术（NGS）分析了CEVd单独侵染及其与CBCVd复合侵染时寄主香橼的反馈调节，对CEVd和CBCVd间存在的交叉保护机制进行了分析。 一、遗传多样性分析 （1）CEVd和CBCVd毒源的鉴定及遗传多样性分析 为明确不同地域间柑橘类病毒分离株的差异，选取CEVd和CBCVd分离株构建侵染性克隆，本研究对实验室保存的类病毒资源进行了鉴定与遗传多样性分析。通过对来自巴基斯坦的柑橘样品进行转录组测序分析，获得了CEVd、CBLVd、HSVd、CBCVd、CDVd和CVd-V的全基因组序列。从巴基斯坦柑橘样品中获得的CEVd、CBLVd、HSVd、CDVd和CVd-V序列与已报道的序列差异较小，巴基斯坦CEVd序列（Contig-4665）与从中国柑橘品种“眉山9号”分离得到的中国CEVd分离株主序列完全相同。新发现的巴基斯坦CBCVd序列与CBCVd RefSeq序列（NC_003539）具有较低的序列相似性（80.9％~88.9％），暂命名为“CBCVd-LSS”。对巴基斯坦和中国CBCVd序列的分子特征分析发现，来自中国的CBCVd序列长度为282~286nt，而来自巴基斯坦的CBCVd序列长度为273~277nt。巴基斯坦CBCVd序列与来自中国和其它国家的CBCVd序列在基因组和二级结构上差异显著，分析认为巴基斯坦可能是CBCVd的独立地理起源之一。因与参照序列具有较高序列同源性，来自“眉山9号”的CEVd分离株和来自“朱见”的CBCVd分离株被筛选出来用以进行侵染性克隆构建实验。 （2）CEVd和CBCVd侵染性克隆的构建与子代种群遗传多样性分析 本研究报道了一种通过一步法RT-PCR快速制备CEVd的cDNA二聚体的方法，并验证了获得的二聚体cDNA的转录产物可以成功侵染寄主植物。另外，这种快速制备cDNA二聚体的方法也适用于CBCVd。本研究制备类病毒二聚体cDNA的方法与传统方法相比精简了步骤，获得的类病毒RNA可以在植物组织中完成系统侵染，表明应用这种方法制备CEVd（CBCVd）二聚体cDNA是可行的。 本研究对CEVd和CBCVd侵染香橼后的子代种群的分析表明，CBCVd子代种群有更复杂的种群结构和更高的变异水平，单倍型多样性和核苷酸多样性也更为丰富。两者子代种群均具有复杂的变种序列，尤其是在CBCVd子代种群序列中发现了一条出现频率接近原始接种序列但不同的优势序列。以上结果表明在用单一柑橘类病毒序列接种香橼后，柑橘类病毒迫于宿主选择压力会形成复杂的种群结构以适应寄主环境，从而产生复杂的遗传多样性。 二、拮抗机制分析 （1）香橼对CEVd侵染的响应机制分析 本研究利用CEVd侵染的香橼来研究木本寄主对CEVd侵染在转录组和小RNA（sRNA）水平上的反馈调节机制，并对深度测序结果的可靠性进行了定量PCR验证。转录组测序结果显示CEVd侵染引起香橼叶片广泛的变化，激活基因沉默通路、触发基础防卫反应、破坏植物激素稳态等。CEVd在寄主香橼中的复制诱导典型的抗类病毒防御反应RNA沉默途径中编码关键蛋白DCL2(Dicer-like2)、RDR1(RNA-dependent RNA polymerase1)、AGO2(Argonaute2)、AGO7的基因显著上调表达。在CEVd侵染的香橼植物中与基础防卫反应有关的基因也被显著诱导，编码核苷酸门控离子通道(CNGCs)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、钙结合蛋白(CMLs)、富亮氨酸重复类受体蛋白激酶(FLS2)和呼吸爆发氧化酶(Rboh)的基因显著上调，编码抗病蛋白、致病相关蛋白以及热激蛋白70(HSP70)的基因也得到积累以响应CEVd侵染。植物激素信号转导途径在CEVd侵染香橼中发生改变，CEVd侵染的香橼植株有明显矮化现象，可能与CEVd侵染后生长素(IAA)信号转导通路被抑制有关。CEVd侵染激活茉莉酸(JA)介导的信号转导途径，赤霉素(GA)和油菜素内酯(BR)信号转导通路也被CEVd侵染诱导。sRNA深度测序数据显示CEVd侵染引起香橼sRNA水平的广泛变化。CEVd侵染可以在整体上影响香橼宿主非编码RNA（ncRNA）的表达，以及诱导21-nt、22-nt的sRNA的生成，相对抑制24-nt sRNA的产生。本研究共鉴定到116种差异表达的微小RNA（DEmiRNA）响应CEVd的侵染，一些DEmiRNA靶基因与RNA沉默反应、植物基础防卫反应、植物激素信号转导等生物胁迫反应相关，sRNA或许可通过调节其靶基因的表达参与类病毒与寄主的互作反应，广泛参与寄主香橼对CEVd的反馈调节。以上结果表明，RNA沉默机制和香橼植物基础防卫机制共同应对CEVd侵染，有助于我们深入理解CEVd的致病机制。 （2）CBCVd对CEVd拮抗作用分子机理的分析 CEVd和CBCVd基因组序列在右手末端区有80~90-nt高度同源，两者复合侵染可减弱枳壳砧木的裂皮症状。本研究在二者复合侵染的香橼中发现，CEVd前期侵染过程中在分子水平上CBCVd对CEVd有显著的拮抗表现，症状表现上也有一定的拮抗表现。通过转录组学和蛋白组学分析，在不同柑橘类病毒侵染的香橼中观察到宿主植物相似的响应调节机制。sRNA深度测序分析发现CEVd和CBCVd侵染均能诱导香橼21~22-nt sRNA的积累。数据分析结果显示来源于CEVd和CBCVd的sRNA大小均以21-nt和22-nt为主且CEVd和CBCVd来源的sRNA在同源区域显著富集。CEVd和CBCVd正负链来源的21-nt和22-nt大小的sRNA的5’碱基偏好性均以U和C为主，仅是U和C占比不同，复合侵染时对基因沉默通路AGO蛋白应存在一定的竞争。CEVd和CBCVd来源sRNA中22-nt大小的sRNA最为丰富，主要由DCL2产生的22-nt sRNA以及RDR1与沉默扩增相关，分析认为DCL2和RDR1可能在类病毒与香橼的互作中处于重要位置。以上结果表明RNA沉默机制参与柑橘类病毒与其宿主的互作，香橼上CBCVd对CEVd存在拮抗表现，拮抗机制应与两者同源区域产生的大量相同类型的sRNA和RNA沉默通路有关。CEVd和CBCVd在两者同源区域产生大量相同类型的sRNA，以及这些sRNA在基因沉默通路中扮演的重要角色，或许可以帮助我们理解二者在香橼寄主上引起相似症状及存在拮抗作用可能的分子机制。

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