柑桔裂皮类病毒快速检测技术的研究及湖北分离物的克隆

摘要

该研究采用聚丙酰胺双向凝胶电泳、反转录-PCR和核酸杂交三种方法对柑桔裂皮类病毒进行了快速检测方法的研究,并成功地分离到了柑桔裂皮类病毒的湖北分离物,对春进行了鉴定和序列分析,具体研究结果如下:1、柑桔裂皮类病毒快速检测技术体系的建立聚丙燃酰胺双向凝胶电泳法检测:将从阳性材料上提取的类病毒核酸,先在6﹪的聚丙烯酰胺非变性胶上进行第一向电泳,然后切割含类病毒分子的胶条,在变性条件下进行垂直或反向电泳,最后银染观察.试验发现,阳性样品的落后于寄主植物核酸带的位置均可见一条类病毒分子带,而阴性对照则没有这条带.该方法具有快速简便、经济实用的特点.反转录-PCR检测:参考已报道的CEVd核苷酸序列合成引物,分别对中柑所和意大利阳性样品进行RT-PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳,发现在370bp左右的位置上有特异性扩增条带,而且可以应用于待检样品的检测.该检测方法特异性强、敏感性高,检测结果稳定、可靠,尤其适合于田间样品的大规模检测.核酸杂交法检测:利用已经克隆的美国柑桔裂皮类病毒cDNA序列,制备生物素标记的核柑酸探针,采用班点杂交的方法和组织印迹的方法分别对阳性材料进行杂交检测,通过胶片曝光显示杂交信号,发现在两种方法的检测结果中阳性材料都有强的反应,而阴性材料无反应或较弱,该方法安全可靠、快速准确,适合大量样品的检测.2.柑桔裂皮类病毒湖北株系的分离鉴定与测序从湖北省秭归县采集罗伯逊脐橙枝条,采用聚丙烯酰胺双向凝胶电泳、RT-PCR及Dot-blotting方法检测到了柑桔裂皮类病毒,然后将其嫁接于指示植物香橼861-S-1上,表现出CEVd的典型症状,从而证实其为CEVd分离物,并命名为CEVd-HB,并对其进行克隆、测序.这是中国首次进行CEVd完整核苷酸序列的测定,GenBank登录号为AY456136.将CEVd-HB与国外已报道的CEVd株系进行同源性比较,发现其与弱毒株系CEVd-de26的同源性最高,为99.2﹪.与GenBank上登录的57个株系作序列系统进化树分析,发现其与从美国分离的三个株系具有很高的亲源性.

目录

Abstract

缩略词表

1文献综述

1.1植物病原类病毒研究进展

1.1.1概述

1.1.2分类

1.1.3复制

1.1.4致病机理

1.1.5起源与进化

1.1.6发展趋势

1.2柑桔裂皮类病毒研究进展

1.2.1概述

1.2.2症状及分布危害

1.2.3株系分化

1.2.4致病性

1.2.5检测方法

1.2.6防治措施

2研究的目的和意义

3材料与方法

3.1材料

3.1.1质粒、菌株、样品

3.1.2酶及主要试剂

3.1.3抗生素及培养基的配制

3.1.4质粒提取液

3.1.5 PAGE的相关试剂

3.1.6核酸杂交的相关试剂

3.1.7其它溶液

3.1.8 RT-PCR引物的设计及合成

3.2方法

3.2.1 CEVd RNA的提取

3.2.2聚丙烯酰胺双向凝胶电泳

3.2.3 CEVd的RT-PCR扩增

3.2.4核酸杂交检测CEVd RNA

3.2.5 DNA片段的回收与纯化

3.2.6转化载体的构建

3.2.7大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化

3.2.8电击转化大肠杆菌

3.2.9质粒DNA的制备和纯化

3.2.10 CEVd的生物学性状观察

4结果

4.1 CEVd快速检测体系的建立

4.1.1聚丙烯酰胺双向凝胶电泳检测CEVd

4.1.2 RT-PCR检测CEVd

4.1.3核酸杂交检测CEVd

4.2 CEVd湖北分离株克隆与测序

4.2.1感染CEVd柑桔样品的收集与鉴定

4.2.2 CEVd-HB株的序列分析

5讨论

5.1 CEVd核酸的制备对检测的影响

5.2 CEVd的三种检测方法的特点

5.3 CEVd-HB分离物特征

参考文献

致谢