鸡α干扰素的克隆、原核表达及其抗病毒效果研究

摘要

干扰素是一类动物机体产生的多功能蛋白，它可由病毒感染而自发产生并随血液循环至全身，激活细胞内抗病毒作用机制合成各种抗病毒蛋白以抵抗病毒的侵扰。由于它高效的广谱抗病毒活性和免疫调节活性以及其无可替代的临床应用价值，从人类发现干扰素开始，就从未停止过对它的探索研究。近年来，各种动物干扰素的研究取得了突破性进展，尤其是α干扰素在抗病毒感染等方面显出良好的效果。我国是最大的养禽国，然而病毒病一直困扰着我国养禽业，造成养禽业巨大的经济损失。因此需要干扰素类细胞因子和DNA重组技术生物治疗制剂来防治禽类疾病。 本研究着眼于克隆并表达鸡α干扰素（ChIFN-α），在体内和体外探讨重组ChIFN-α蛋白抵抗禽类病毒的效果。具体的研究有以下几个方面： 1．ChIFN-α基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 通过PCR从三黄肉鸡的肝脏基因组中扩增了ChIFN-α全长基因，序列分析表明ChIFN-α基因全长582bp。亚克隆其成熟蛋白编码基因489bp，利用基因重组技术构建了E.coli／pET-28a（＋）-IFNα，使IFNα置于pET-28a的T7启动子下游并同6×His-Tag（多聚组氨酸标签）融合。经酶切鉴定，DNA测序证实重组质粒构建正确；经SDS-PAGE分析，表达产物为22kD左右的融合蛋白，并且蛋白以不溶性的包涵体形式存在。Westem-blot印迹及斑点杂交分析证实表达产物具有良好的免疫学活性。 2．两种纯化方法获得的表达蛋白产物的抗病毒效果比较研究 通过提取包涵体法和镍亲和层析法分别对表达产物进行纯化，变性和复性，获得了具有较高生物活性的重组鸡干扰素，提纯的包涵体可占总蛋白的70％以上，用镍亲和层析方法纯化蛋白则可达到95％。对这两种方法提纯的蛋白进行了鸡胚试验和雏鸡试验，分析并比较了它们抵抗禽类病毒的效果，试验均表明亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20倍左右，表明蛋白纯度越高，复性越好，生物活性也越好。 3．重组鸡α干扰素抗禽类病毒效果 在体外试验中，复性的蛋白在鸡胚成纤维细胞上能够抑制H9N2禽流感病毒的复制。体内试验显示，鸡胚试验组中重组干扰素抵抗H9N2禽流感病毒效果显著，能保护鸡胚并使其孵出率达到100％的重组干扰素最小蛋白含量为2μg，表明微量的干扰素就能起到抗病毒的作用；重组鸡干扰素在鸡胚内能够延迟和减少新城疫强毒株（NDV）的复制，延迟时间为12h至24h。该试验重复性好，抗病毒活性随着蛋白含量的增加而增高；雏鸡试验组中重组干扰素也能够抵抗H9N2禽流感病毒的感染。

目录

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摘要

1文献综述

2研究目的与意义

3材料与方法

4结果

5讨论

6小结

参考文献

缩略词

附录

致谢