鸡α干扰素基因克隆、原核表达及抗病毒活性研究

摘要

家禽传染性疾病是养禽业最大的威胁，给养殖业造成严重经济损失。干扰素(IFN)是一类重要的细胞因子，具种属特异性，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等多种生物活性。因此研发具有广谱抗病毒作用的鸡干扰素具有重大的意义。 参照GenBank上登陆的鸡α干扰素基因序列设计一对引物，应用PCR技术直接从河南大面积饲养的罗曼鸡、海兰鸡及地方品种固始鸡肝组织基因组DNA中扩增鸡α干扰素基因。将扩增得到的特异性片段克隆入pGEM-TEasy载体中，转化感受态细胞JM109，运用蓝白斑筛选、质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性可疑菌株，并将筛选的阳性菌株送往大连宝生物测序。测序结果表明，得到了上述3个品种鸡α干扰素基因，大小均为582bp，除去93个信号肽，共编码162个氨基酸。用DNAstar序列分析软件对其进行同源性分析，核苷酸同源性均在99.3％以上，氨基酸同源性均在97.9％以上。 在此基础上，重新设计一对引物，从pGEM-TEasy载体中扩增鸡α干扰素成熟肽蛋白基因用SphⅠ和SalⅠ双酶切后，再将其插入同样经SphⅠ和SalⅠ双酶切的原核表达载体pQE30中，构建了鸡α干扰素原核表达载体pQEIFN-α。转化感受态细胞JM109，经PCR、酶切鉴定并进行序列测定，结果表明，将ChIFN-α成熟肽蛋白基因正确地插入到原核表达载体pQE30的目的位点，重组质粒pQEIFN-α转化受体菌M15后用IPTG诱导，实现了鸡α干扰素在大肠杆菌M15中的表达，表达产物经SDS-PAGE电泳后在约20.0Ku处出现了特异性条带，用1.0mmoL/LIPTG于37℃诱导8h表达产物最佳，用鼠抗鸡IFN-α单克隆抗体作一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体作二抗，Westernblotting检测出现了特异性的条带。表达产物以包涵体形式存在，包涵体经变性、复性处理后，用细胞病变抑制法测定活性，结果表明重组鸡α干扰素在Vero细胞上抗VSV的病毒活性为1.16×103U/mg。 与人和哺乳动物比较，鸡IFN-α的研究相对来说比较滞后。本研究利用体外表达技术成功研制重组IFN-α蛋白，为研制抗鸡IFN-α的多克隆抗体和单克隆抗体以及ChIFN-α蛋白的生物学特性的研究奠定基础。

目录

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致谢

摘要

1文献综述

引言

3材料与方法

4结果与分析

5讨论与结论

参考文献

附录