猪α干扰素、猪β干扰素与猪γ干扰素的抗病毒活性及其免疫佐剂的研究

摘要

干扰素(IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子。自1957年Isaaes和Lindenmann首先发现干扰素(IFN)以来，人们对IFN韵研究、开发及应用从未停止过，目前IFN已被广泛应用于人医临床多种疾病的治疗。1980年WHO根据IFN抗原特异性的不同将其分为三类：IFN-α、IFN-β、IFN-γ；后来又依IFN作用的受体不同而分为两型：Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN，Ⅰ型包括IFN-α、β、w、τ、δ等；Ⅱ型只有IFN-γ。 相对而言，兽医界对动物干扰素的研究起步较晚。由病毒、细菌等病原微生物侵染动物所引起的各种传染性疾病严重制约了各个国家和地区养殖业的健康发展，同时也对人类健康存在着巨大隐患。因此，研究动物干扰素对动物传染性疾病的防治措施研究具有重大的经济价值和社会意义。鉴于此，本研究以猪干扰素alpha(PoIFN-α)、猪干扰素beta(PolFN-β)与猪干扰素gamma(PolFN-γ)为研究对象，开展了这三种细胞因子对PRV、PRRSV、FMDV抗病毒活性的研究，及其以蛋白或基因形式对猪瘟疫苗的佐剂效应的研究。主要研究内容包括： 1、PolFN-γ基因的克隆、测序分析及其原核表达 以刀豆素A(ConA)诱导的梅山猪外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板，采用RT-PCR方法克隆扩增出全长猪丫干扰素基因(PoIFNγ，501bp)。经测序结果证实扩增得到的PoIFNγ与Genbank上所报道的猪γ干扰素基因同源性为100％；与羊、鹿、骆驼、牛、马、兔、人、鼠的氨基酸序列同源性分别78％、77％～80％、79％～80％、77％、71％、60％、59％～60％、43％。将PoIFNγ插入pGEX-KG表达载体，并转化宿主菌BL<,21>，经IPTG诱导后，得到高效表达。表达产物经SDS-PAGE分析，证明PoIFN-γ与GST融合表达，主要形成不溶性包涵体，经GelExpert软件分析确定不可溶性融合蛋白约占总蛋白的69.91％，可溶性蛋白占15.64％，大小约为43 kDa。通过对宿主菌不同时间的诱导发现目的蛋白在诱导后5小时的表达量最高，可达0.86 mg/mL。将表达产物变性、复性、透析、纯化处理后加入牛肾细胞 (MDBK) 上，用水泡性口炎病毒(VSV)攻毒，测出重组的PoIFNγ具有较高的抗病毒作用，生物活性达到1.0×10<'5>U/mg。 2、PoIFN-α、PoIFN-β和PoIFN-γ的酵母分泌表达及PoIFN-β对FMDV的抑制作用 为了获得高效分泌表达的重组猪α、β、γ干扰素，利用基因工程技术，分别将编码梅山猪α、β、γ干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα/β/γ，501/498/435 bp)，亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC 9K中，构建成分泌型重组表达载体pPIC 9K-mPoIFNα/β/γ。用化学方法(LiCl)，将线性化的mPoIFNα/β/γ与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115，转化子经MD平板筛选租PCR鉴定后，得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选到多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1％甲醇连续诱导4天，表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明在毕赤酵母中猪α、β、γ干扰素获得分泌型表达，对表达产物进行理化分析及细胞病变抑制法(CPE<,50>)测定结果表明，表达产物具有较高的抗病毒生物活性。此外，酵母表达的PoIFN-β对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。 3、猪α、β、γ干扰素在不同细胞系中的表达及其单独或联合作用对PRV增殖的抑制效果的比较 分别构建3种真核表达质粒：pcDNA-PoIFNα(pcD-PoIFNα)、pcDNA-PoIFNβ(pcD-PoIFNβ)与pcDNA-PoIFNγ(pcD-PoIFNγ)，分别转染HeLa、MDBK、BHK-21、PK-15及IBRS-2细胞。于转染后6、24、48、72小时检测转染细胞上清中的抗病毒活性(MDBK/VSV)。结果发现，在五种细胞中干扰素的表达量均在转染后48小时达到高峰。转染了pcD-PoIFNα的PK-15，IBRS-2和BHK-21细胞是同样转染的MDBK和HeLa细胞中表达的PoIFNα的活性的256～890倍；而转染了pcD-PoIFNβ的IBRS-2和BHK-21细胞比同样转染的PK-15和HeLa细胞中表达的PoIFNβ的活性高2.2～6倍，后两种细胞又比MDBK细胞转染后表达PoIFNβ的活性高10～14倍。对于五种转染pcD-PoIFNγ的细胞，在PK-15、IBRS-2、BHK-21和MDBK之间没有显著差异。 在本研究中还比较了猪α、β、γ干扰素、及其两两联合预处理IBRS-2细胞后对PRV增殖的抑制作用。结果发现在三种干扰素中 PoIFN-β能最有效的抵制PRV的增殖——100U/mL PoIFN-β就能使PRV空斑数目减少5.3倍；PoIFN-γ则能抑制PoIFN-γ达3.3倍；而PoIFN-α仅能抑制空斑数目1.26倍，且即使将其浓度上调至12800U/mL 其抑制倍数也仅提高至2.3倍。当PoIFN-γ与PoIFN-α或PoIFN-β联合作用时其抑制PRV 空斑数目分别达到12.8倍和100倍。而PoIFN-α或PoIFN-β与PoIFN-γ联合作用时也可有效抑制PRV复制达29和146倍。此外，实时定量PCR结果也显示了当PoIFN-γ与PoIFN-α或PoIFN-β联合刺激IBRS-2细胞时，PRV的立即早期基因mRNA比对照细胞减少23.8或133.0倍。实验结果均表明PoIFN-γ能与PoIFN-α或PoIFN-β在体外产生协同抗PRV作用。 4、重组腺病毒介导的猪α、β、γ干扰素的表达及rAd-PoIFNα抗PRRSV作用 分别将猪α/β干扰素(PoIFN α/β/γ)基因插入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV，构建成重组质粒pSh-PoIFNα/β/γ。将此重组质粒经Pine Ⅰ线性化和去磷酸化后回收，与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共同电转化BJ5183感受态细胞，在Kan平板上37℃培养24h，挑选较小的菌落，提取的重组质粒经Pac Ⅰ鉴定正确的阳性克隆命名为pAd-Sh-PoIFNα/β/γ，转化XL10-Gold 感受态后大量制备。pAd-Sh-PoIFNα/β/γ以PacⅠ线性化后回收，用脂质体转染法转染293A包装细胞系，转染7～10天出现典型的细胞病变，说明重组了猪α/β/γ-干扰素的腺病毒基因组(缺失E1和E3基因)在其包装细胞系中成功包装成完整的病毒粒子。将此重组后的腺病毒连续接种传代，每代提取病毒基因组，PCR均能扩增出目的片段，证明该种表达猪α/β/γ-干扰素的重组腺病毒能稳定传代。利用细胞病变抑制法，收取病变后293A细胞上清，在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测，结果显示猪α/β/γ干扰素的抗病毒(VSV)活性分别达83640320U/mL、5242880U/mL、1310720U/mL，说明重组腺病毒成功转导猪干扰素基因，并表达出具有良好生物学活性的猪干扰素。分别以由腺病毒介导的100U/mL，400U/mL 和327680U/mL PoIFN-α预处理MARC-145细胞，同时设空白腺病毒对照。20小时后，感染不同TCID<,50>的PRRSV，逐日观察细胞病变，结果发现，高剂量的PoIFN-α能有效抑制细胞病变且呈一定的剂量相关及时间相关关系。此外，实时定量PCR结果也表明即使是低剂量的PoIFN-α也能抑制PRRSV的ORF7和Nsp9基因的表达。该实验结果预示rAd-PoIFNα能有效抑制PRRSV在体外的增殖并有望应用于临床对PRRSV的防制。 5、猪α、γ干扰素增强CSFV细胞苗(c-strain)在猪体内的IgG及lgG2的抗体水平并调节Th1免疫反应 分别将表达的猪α、γ干扰素蛋白(1×10<'6>U、2×10<'5>U、5×10<'4>U/头份)或猪α、γ干扰素真核质粒(400μg/头份)与CSFV细胞苗(c-strain)联合免疫仔猪。结果发现，二免后联合免疫2×10<'5>U/头份或5×10<'4>U/头份重组蛋白猪α干扰素或三种剂量的猪γ干扰素与单独免疫细胞苗的对照组相比能显著提高特异性 IgG的滴度。而在首免后，联合免疫10<'6>U/头份猪α干扰素或任一剂量的猪γ干扰素能比细胞苗对照组或联合免疫pcD-PoIFNγ/显著提高特异性IgG2的滴度。此外，它们还能将IgG2/IgG1的比率向Th1免疫方向调节，尤其是在联合免疫2×10<'5>U/头份猪γ干扰素的试验组。试验结果表明，猪γ干扰素比猪α干扰素具有更强的免疫调节能力，它能有效地提高IgG、IgG1、IgG2的抗体滴度并将免疫反应调向Th1。此外，研究也表明，干扰素蛋白比真核质粒介导的干扰素更适合作为免疫调节剂；而猪γ干扰素对IgG及IgG1的调控在一定范围呈剂量负相关，猪γ干扰素对IgG的调控呈剂量正相关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词(Abbreviation)

声明

第1章文献综述

1.1干扰素简介

1.2 α-干扰素

1.2.1来源

1.2.2结构特征

1.2.3生物学功能

1.2.4 α-干扰素受体

1.2.5 临床应用

1.3 β-干扰素

1.3.1 β-干扰素的来源

1.3.2 β-干扰素的结构特点

1.3.3 β-干扰素的生物学活性

1.3.4 β-干扰素的临床应用

1.4γ-干扰素

1.4.1γ-干扰素的来源

1.4.2γ-干扰素的结构特点

1.4.3 γ-干扰素的生物学活性

1.4.4γ-干扰素的临床作用

1.5 IFN及其相关基因的表达调控

1.5.1 IFN的诱导

1.5.2 IFN表达调控

1.5.3 IFN激活基因的表达

1.6干扰素的作用机理

1.6.1 IFN发挥作用的信号转导通路

1.6.2 IFN信号的调节因素

1.6.3 IFN的抗病毒作用机理

1.6.4 IFN的免疫调节机理

1.7猪干扰素的基因工程

1.7.1猪α干扰素的基因工程

1.7.2猪β干扰素的基因工程

1.7.3猪γ干扰素的基因工程

1.8细胞因子佐剂

1.9重组蛋白表达系统简述

1.9.1大肠杆菌表达体系

1.9.2酵母表达体系

1.9.3哺乳动物细胞表达系统

第2章研究目的与意义

第3章材料与方法

3.1试验材料

3.1.1质粒与菌株

3.1.2细胞、毒株与疫苗

3.1.3实验动物

3.1.4生化试剂

3.1.5主要培养基

3.1.6缓冲液

3.1.7 E.coli感受态制备用试剂

3.1.8 Pichia pastoris感受态制备用试剂

3.1.9 ELISA缓冲液

3.1.10其它缓冲液

3.2试验方法

3.2.1猪外周血白细胞的分离及诱导培养

3.2.2猪γ-干扰素总RNA的提取

3.2.3 RT-PCR扩增PoIFN-γ

3.2.4 RT-PCR产物的回收与纯化

3.2.5 RT-PCR产物的克隆

3.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备

3.2.7连接产物及质粒的转化

3.2.8重组质粒的快速鉴定

3.2.9质粒的制备

3.2.10干扰素的原核表达

3.2.11干扰素多克隆抗体的制备

3.2.12干扰素的酵母表达

3.2.13干扰素的真核表达及其抗PRV作用

3.2.14重组腺病毒介导的猪α、β、γ干扰素的表达及其猪α干扰素抗PRRSV作用

3.2.15猪α、γ干扰素增强针对CSFV细胞苗(c-strain)的IgG及IgG2的抗体水平并调节Th1免疫反应

第4章结果与分析

4.1 PoIFN-γ的克隆及其原核表达

4.1.1 PoIFN-γ全基因的克隆、测序及序列分析

4.1.2 PoIFN-γ原核表达载体的构建

4.1.3融合蛋白的诱导表达

4.1.4融合蛋白最佳诱导时间的测定

4.1.5融合蛋白的可溶性分析

4.1.6 Western blot分析及抗病毒活性

4.2 PoIFN-α，PoIFN-β和PoIFN-γ的毕赤酵母表达

4.2.1 PoIFN-α的毕赤酵母表达

4.2.2 PoIFN-β的毕赤酵母表达

4.2.3 PoIFN-γ的毕赤酵母表达

4.3 PoIFN-α，PoIFN-β和PoIFN-γ在不同细胞系中的真核表达及其单独或联合作用对PRV增殖的抑制效果的比较

4.3.1 PoIFN-α，PoIFN-β和PoIFN-γ真核表达质粒的构建

4.3.2间接免疫荧光检测PoIFN-α/β/γ在PK-15细胞中的表达

4.3.3 PoIFN-α/β/γ在HeLa、MDBK、BHK-21、IBRS-2和PK-15细胞中的表达

4.3.4 PoIFN-α/β/γ在MDBK和BHK-21细胞中mRNA水平的差异

4.3.5 PoIFN-α/β、PoIFN-γ及其联合作用抑制PRV空斑形成

4.3.6 PoIFN-α/β和PoIFN-γ联合协同抑制PRV的复制

4.3.7PoIFN-α/β和PoIFN-γ并不直接抑制PRV在IBRS-2细胞上的吸附

4.3.8 PoIFN-α/β和PoIFN-γ抑制PRV IE mRNA的生成

4.4重组腺病毒介导的猪α、β、γ干扰素的表达

4.4.1重组腺病毒介导的猪α干扰素的表达

4.4.2重组腺病毒介导的猪β干扰素的表达

4.4.3重组腺病毒介导的猪γ干扰素的表达

4.5猪α、γ干扰素增强针对CSFV细胞苗(C-strain)的IgG及IgG2的抗体水平并调向Th1免疫反应

4.5.1特异性抗CSFV的IgG抗体

4.5.2特异性抗CSFV的IgG1抗体

4.5.3特异性抗CSFV的IgG2抗体

4.5.4 IgG2/IgG1比率

第5章讨论与结论

5.1 PoIFN-γ的表达

5.1.1 PoIFN-γ基因的克隆

5.1.2 PoIFN-γ的原核表达

5.1.3 PoIFN-γ在P. pastoris中的表达

5.1.4 PoIFN-γ在腺病毒表达系统中的表达

5.2 PoIFN-α的表达

5.2.1 PoIFN-α在P. pastoris中的表达及纯化

5.2.2 PoIFN-α在腺病毒系统中的表达

5.3 PoIFN-β的表达

5.3.1 PoIFN-β在P. pastoris中的表达及纯化

5.3.2 PoIFN-β在腺病毒系统中的表达

5.4干扰素抗病毒作用的研究

5.4.1腺病毒介导的PoIFN-α对PRRSV增殖效力的影响

5.4.2真核表达的PoIFN-α、PoIFN-β及PoIFN-γ对PRV增殖效力的影响

5.5猪α、β、γ干扰素对CSFV细胞疫苗的佐剂效应研究

5.6结论

参考文献

致谢

附录