三种食源性致病菌的多重实时PCR检测研究

摘要

随着经济的发展和人们生活水平的提高,食品安全问题越来越受到重视。最为常见的食品安全事件大都是由于致病微生物引起的,而食源性致病菌所导致的食品安全事件在其中占有很大的比重。沙门氏菌、E.coli O157:H7、单增李斯特氏菌是肉类中常见的病原菌,给人们的生命安全构成重大威胁,每年都会给世界贸易造成重大损失。因此,迫切需要建立一种快速、准确检测这三种致病菌的检测方法,为这三种致病菌的检测提供有效的检测手段。为此,本研究利用改良分子信标技术建立了检测肉类中沙门氏菌、E.coli O157:H7、单增李斯特氏菌的单一和多重实时PCR方法。分别根据沙门氏菌的ttrRSBCA基因、E.coli O157:H7的rfbE基因和单增李斯特氏菌的hlyA基因设计了引物和改良分子信标。通过比较选出最佳引物探针组合,并优化建立针对单一细菌基因检测的单一实时PCR检测体系。
　　为了评价所建立的实时PCR检测体系的特异性,实验中选取了大量的阳性菌株及干扰菌株进行特异性验证。同时对梯度稀释的纯化DNA和标准菌株菌液进行检测以确定方法的灵敏度。各单一实时PCR检测体系具有良好的特异性,没有假阴性出现。沙门氏菌、单增李斯特氏菌、E.coli O157:H7单一实时PCR体系检测纯化DNA的灵敏度分别为100 fg/PCR体系、100fg/PCR体系和10 fg/PCR体系,标准曲线分别在100 fg/PCR体系~100 ng/PCR体系、100 fg/PCR体系~100 ng/PCR体系和10 fg/PCR体系~100 ng/PCR体系范围内呈良好的线性相关,R~2>0.99;各单一实时PCR检测体系检测相应目标菌菌液的灵敏度分别为4,700 CFU/mL(相当于235 CFU/PCR体系)、12,150 CFU/mL(607.5 CFU/PCR体系)和263CFU/mL(13.15 CFU/PCR体系),标准曲线分别在在10~3 CFU/mL~10~8 CFU/mL、10~4 CFU/mL~10~8 CFU/mL和10~2 CFU/mL~10~8 CFU/mL范围内呈良好的线性相关,R~2>0.99。在单一实时PCR检测体系的基础上进一步优化建立了三联实时PCR检测体系。除检测E.coli O157:H7灵敏度略有降低外(131.5 CFU/PCR体系),检测另外两种致病菌的灵敏度与单重检测体系相同,沙门氏菌、单增李斯特氏菌和E.coli O157:H7梯度稀释菌液检测的标准曲线分别在在10~3 CFU/mL~10~8 CFU/mL、10~5 CFU/mL~10~8 CFU/mL和10~3 CFU/mL~10~8 CFU/mL范围内呈良好的线性相关,R~2>0.99。
　　利用建立的三联实时PCR检测方法对539份肉类制品进行了检测,共检出沙门氏菌阳性21份,单增李斯特氏菌阳性7份,E.coli O157:H7阳性13份。经标准检测方法确认,21份沙门氏菌均为阳性,5份单增李斯特氏菌阳性,E.coli O157:H7没有阳性。研究结果说明,本课题所建立的检测肉类中常见致病菌沙门氏菌、单增李斯特氏菌和E.coli O157:H7的方法简便、快速、特异,各项技术指标满足国内外法规的要求,将为肉类致病菌污染的检疫以及临床标本的检测提供技术手段;本课题的完成成果也为国家和地区的检验检疫部门制订相关的检测标准提供实验基础。

目录

摘要

Abstract

缩略词(Abbreviation)

1 文献综述

1.1 三种食源性致病菌的危害

1.1.1 沙门氏菌的危害

1.1.2 单增李斯特菌的危害

1.1.3 E.coli O157:H7的危害

1.2 目前常用的检测方法

1.2.1 细菌分离鉴定法

1.2.2 免疫学方法

1.2.3 全自动微生物分析系统检测

1.2.4 ISO-GRID膜过滤系统

1.2.5 API法

1.2.6 分子生物学方法

2 目的和意义

3 材料和方法

3.1 材料

3.1.1 菌株

3.1.2 实验仪器

3.1.3 试剂

3.2 实验方法

3.2.1 菌株的培养

3.2.2 模板的制备

3.2.3 引物和探针的设计与合成

3.2.4 引物和探针的处理

3.2.5 普通 PCR反应体系的建立

3.2.6 单重实时PCR体系的建立

3.2.7 特异性实验

3.2.8 单重实时PCR灵敏度实验

3.2.9 三联实时PCR体系的构建及灵敏度的考查

3.3 样品检测

4 实验结果

4.1 沙门氏菌的单重实时PCR

4.1.1 引物和探针的设计及检测体系的建立

4.1.2 沙门氏菌特异性实验

4.1.3 沙门氏菌反应体系灵敏度实验

4.2 单增李斯特氏菌的单重实时PCR

4.2.1 引物和探针的设计及检测体系的建立

4.2.2 单增李斯特氏菌特异性实验

4.2.3 单增李斯特氏菌反应体系灵敏度实验

4.3 E.coli O157:H7单重实时PCR

4.3.1 E.coli O157:H7引物的设计及单重实时PCR体系的建立

4.3.2 E.coli O157:H7特异性实验

4.3.3 E.coli O157:H7灵敏度检测

4.4 三联实时PCR

4.4.1 三联实时PCR体系的建立

4.4.2 检测混合 DNA

4.4.3 三联实时PCR灵敏度

4.5 样品检测结果

5 讨论

5.1 引物和探针的设计

5.2 实时PCR和改良分子信标的优点

5.3 检测方法的特异性

5.4 检测方法的灵敏性

5.5 多重实时 PCR的优势

5.6 检测方法的时效性

5.7 应用前景

6 结论

7 参考文献

附录 硕士期间发表的论文

致谢