绿茶多糖的酶法修饰改性及构效变化的研究

摘要

茶叶多糖具有很好的降血糖和抗氧化活性，是茶叶中继多酚以后的另一种重要的功能性成分。酶法修饰多糖是近年来研究的热点之一。利用酶法修饰多糖能改变多糖生物活性。本文利用糖苷酶水解绿茶中提取的茶多糖，系统研究酶法修饰前后茶多糖分离纯化技术，理化性质和一级结构，同时比较二者的抗氧化与免疫调节活性，并对二者的溶液行为和微观形貌进行系统的比较。结合酶工程尝试寻找改善茶多糖活性的方法，筛选茶多糖高活性的优势构象。主要研究结果如下：
　　 1茶叶中半乳糖苷酶的初步研究
　　 采用单因素和正交试验方法对茶叶中β-D-半乳糖苷酶的比活力测定条件进行优化。结果表明，茶叶中β-D-半乳糖苷酶比活力测定条件为：以pH4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作为缓冲体系抽提4h，离心处理两次得到酶溶液，以0.2ml10mmol/L的pNPG溶液为底物，置于温度60℃水浴中7min，反应后加入lmol/LNaCO3终止反应。对不同茶叶品种、生长季节以及不同嫩度叶片中的β-D-半乳糖苷酶比活力进行分析。结果表明，乌龙茶与绿茶品种中β-D-半乳糖苷酶比活力差异明显，不同季节与不同嫩度茶叶叶片之间也存在较大变化。4月和7月，两种糖苷酶的活性都比较高，芽具有较高的糖苷酶活性。比较毛蟹和铁观音两个品种乌龙茶加工过程β-D-半乳糖苷酶与β-D-葡萄糖苷酶的变化，表明毛蟹和铁观音β-D半乳糖苷酶活性都呈显著的下降趋势，但铁观音中β-D-葡萄糖苷酶活性则呈先降后升再降的趋势。
　　 2绿茶多糖的酶法改性及其对体外抗氧化活性和免疫活性的影响
　　 利用茶叶中提取的糖苷酶对绿茶多糖进行酶法修饰改性，以茶多糖清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力大小为评判指标，结合单因素与正交实验。结果表明，绿茶多糖酶法修饰改性的优化条件为：酶水解温度35℃，多糖浓度5mg/ml，水解时间30min和酶浓度为设定值1。通过酶法修饰改性后的茶多糖，体外清除自由基能力有了显著提高，ETPS与TPS相比较，在清除羟基自由基能力方面较后者提高49％，清除超氧阴离子能力方面提高33%。它们的糖含量与蛋白质差异不大。
　　 首次就茶多糖对环磷酰胺抑制的免疫低下模型小鼠的免疫功能进行了探讨。结果表明，TPS与ETPS在免疫低下模型小鼠的细胞免疫功能，体液免疫功能，单核一巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面的实验中，结果均呈阳性，说明它们均具有明显的增强免疫功能的作用，其作用途径一方面促进免疫器官的修复，另一方面通过增强巨噬细胞、T淋巴细胞、NK细胞的活性和通过体液免疫途径来实现。试验结果还表明，酶法修饰改性能显著提高绿茶多糖的免疫活性。在同等剂量下，改性后的茶多糖ETPS与原多糖TPS相比能提高脾指数、腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，能显著提高DTH试验耳肿程度、血清HC50、NK细胞活性。但在提高胸腺指数、ConA诱导脾淋巴细胞的增殖、溶血空斑数以及小鼠碳廓清吞噬指数方面要比原多糖差一些。提示一方面绿茶多糖经过酶法修饰改性后免疫活性明显增强，有利于提高免疫活性，另一方面也说明多糖经过酶法修饰改性后免疫途径发生了一定变化。
　　 3茶多糖一级结构表征
　　 将酶水解前后的茶多糖经DEAE-52纤维素与Sephadex G-150柱层析分离纯化得到两个相对均一组分TPS2-1和ETPS2-1，通过紫外光谱、红外光谱、核磁共振、气相色谱、高碘酸氧化等方法对它们的的一级结构进行了结构分析比较。结果表明，ETPS2-1中性糖含量低于TPS2-1，糖醛酸含量高于TPS2-1，都具有糖缀合物的特性。TPS2-1的相对分子质量为36.98×104，分散系数(MW/Mn)为2.04，单糖组成及摩尔比：Rha: Rib: Ara: Xyl: Man: Cal: Glu=1.27:0.20:7.19:0.28:0.30：1.25:8.21。ETPS2-1的相对分子质量为18.71×104，分散系数(MW/Mn)为1.81，单糖组成及摩尔比：Rha: Rib: Ara: Xyl: Man: Cal: Glu=1.34:0.05:6.24:0.48:0.13:0.77:7.05。红外光谱分析二者均含有呋喃环和吡喃环。核磁分析表明分子主链主要以β-D葡萄糖苷键(1→4)连接以及(1→6)连接方式链结，阿拉伯糖和半乳糖主要以呋哺型糖苷的形式链接于支链上。
　　 4茶多糖溶液行为与形貌特征研究
　　 利用粘度测定、GPC-LLS、CD、AFM、SEM、以及热特性分析技术研究绿茶多糖酶法改性前后高级结构的变化。结果表明，TPS2-1与ETPS2-1在溶液中的分布都是不均一的，粘度均很低，TPS2-1的特征粘度和分子粒径大于ETPS2-1。CD分析结果表明，多糖主要显示负的Cotton效应，ETPS与TPS分子具有不同的对称性。原子力显微镜(AFM)观察结果表明，TPS2-1多糖分子呈链状结构和分枝叶片状，而ETPS2-1糖分子呈现一些比较规则的圆盘状，圆盘上均匀聚集颗粒状物质。经过改良后的扫描电镜(SEM)观察结果表明，TPS2-1表面光滑，呈现一种片层状形态。ETPS2-1由小颗粒聚集形成规则的片状形态，但没有堆积聚集现象，颗粒状分子排列紧密，呈平铺状态。综合热分析仪分析表明，TPS2-1和ETPS2-1多糖的聚集态中都存在多种结构的聚集状态，所表现出的热特性规律存在一定差异。由此说明绿茶多糖经过酶法修饰改性后，溶液行为和立体形貌特征已经发生明显变化。
　　 利用CD、AFM、SEM方法深入分析酸碱情况下乌龙茶多糖的溶液行为和微观形貌。结果表明，酸碱环境都引起TPS2-1与ETPS2-1多糖分子的不对称性，构象发生显著变化，基本上都呈现酸性环境促进多糖分子的分散，碱性环境则促进分子的聚集的趋势。这种溶液行为和微观形貌的变化对活性有显著影响。
　　 首次利用CD、AFM、SEM方法分析不同金属离子与酶法改性前后茶叶多糖的络合效应与抗氧化活性。结果表明，Pb2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Na+、K+、Mg2+离子中，Pb2+严重抑制了茶叶多糖的抗氧化活性，而Mn2+、Zn2+离子则显著增强了茶叶多糖的抗氧化活性。CD、AFM、SEM分析结果表明，铅离子显著改变了TPS2-1和ETPS2-1链的结构与链构象，打破了多糖分子的特征形态，促进多糖分子无规则的聚集。锰离子主要增加了多糖分子的不对称性，促进多糖分子的分散性，使颗粒状形成比较规则的片层状结构。锌离子也是增加了多糖分子的不对称性，但对茶叶多糖形貌特征的影响会因多糖结构的改变而变化，形成的片层状结构相比锰离子的影响要小一些。由此说明，利用金属离子与茶叶多糖的配位络合效应能设计出高活性茶叶多糖的优势构象。