结核分枝杆菌复合群多重PCR和LAMP检测方法的建立及临床应用

摘要

结核病是一种古老的慢性传染性疾病,由著名生物学家郭霍首于1882年首先发现,结核病和牛结核曾经是引起人畜死亡人数最多的疾病。虽然结核病在历史上曾得到控制,但19世纪以来,由于世界经济的迅速发展,大量人口聚集在城市居住,以及畜牧业的发展,结核病随之大面积流行,并产生了多重耐药性,给人类社会和畜牧业的发展带来了巨大的威胁,另外结核分枝杆菌和牛分枝杆菌能交叉感染,给预防和治疗结核病带来了极大的困难,然而目前临床上缺乏一种有效、快速、廉价的结核病检测方法。
　　本研究建立了一种多重PCR检测方法和LAMP检测方法,为结核病和牛结核的流行病学调查和监控提供了有效的方法,主要研究内容如下:(1)多重PCR检测方法的建立及临床应用。针对结核分枝杆菌四个特异性基因16sRNA、IS6110、RV3873、RV2652设计四对引物,且四对引物具有相同的退火温度,扩增产物的分子量呈梯度排列(分别为824bp、621bp、254bp、418bp),因此在琼脂糖凝胶电泳时能形成四条大小不同的条带,能特异性检测出结核分枝杆菌和牛分枝杆菌,并且能将它们区分开,其检测灵敏度达到50个菌/模板。(2) LAMP检测技术的建立及临床应用。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种具有高特异性和高灵敏度,操作简单快速,低成本的检测方法,本研究针对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌共有的基因序列RV3877设计特异性引物,能检测出结核分枝杆菌和牛分枝杆菌,并且有很高的特异性,灵敏度达到16个菌/模板。(3)取临床分离的234份PPD阳性血样,进行多重PCR检测,检出率为4.7％;从临床肺脏样本中分离得到的42份分离菌,进行多重PCR检测,检出率为30.9％;临床得到的86份PPD阳性的牛鼻拭子样本,进行多重PCR检测,检出率为8.3％,而LAMP的检出率为24.4％;临床分离得到的56份PPD阳性奶样,进行多重PCR检测,检出率为5.4％,而LAMP得检出率为16.1％;取结核病防治所取得74份疑似结核病患者的痰液,进行多重PCR检测,检出率为48.6％,而LAMP得检出率为66.2％。在临床检测中LAMP技术具有高灵敏度,而多重PCR能够将结核分枝杆菌和牛分枝杆菌区分开来。LAMP检测技术适合结核病的检测及大规模流行病调查和监控,而多重PCR技术适合结核分枝杆菌和牛分枝杆菌交叉感染的研究和流行病调查。这两种方法的建立为人和动物结核病的检测和监控提供了有效的途径。

目录

摘要

Abstract

缩略语表

第一章 文献综述

1.1 分枝杆菌的基本特征

1.1.1 分枝杆菌细菌学特征

1.1.2 分枝杆菌的分类

1.2 结核分枝杆菌群的分布及危害

1.2.1 结核分枝杆菌的危害及致病机理

1.2.2 牛分枝杆菌的危害及致病机理

1.3 结核分枝杆菌复合群的基因差异

1.3.1 16s rRNA基因差异

1.3.2 IS1081和IS6110

1.3.3 基因缺失区域

1.4 结核分枝杆菌检测方法

1.4.1 PPD皮试

1.4.2 细菌学分离检测

1.4.3 涂片镜检检测

1.4.4 X光胸透

1.4.5 ELISA检测技术

1.4.6 γ干扰素检测技术

1.4.7 胶体金检测技术

1.4.8 PCR和多重PCR检测技术

1.4.9 实时荧光定量PCR检测技术

1.4.10 LAMP检测技术

1.5 结核病的预治

1.5.1 结核病的防疫

1.5.2 结核病的治疗

第二章 结核分枝杆菌复合群多重PCR检测技术的建立及临床应用

引言

1 目的意义

2 材料方法

2.1 实验材料

2.3 实验方法

3 实验结果

3.1 多重PCR各引物浓度调整

3.2 多重PCR中Mg~(2+)对扩增效率的影响

3.3 多重PCR的最适温度

3.4 各增强剂对多重PCR的扩增效率影响

3.5 循环次数对多重PCR扩增效率的影响

3.6 不同的Taq DNA聚合酶对PCR扩增效率的影响

3.7 PCR回收测序验证其扩增的正确性

3.8 多重PCR特异性的检测

3.9 多重PCR敏感性的检测

3.10 模拟临床阳性样本检测

3.11 阴性样本验证性检测

3.12 临床检测结果

4 讨论

4.1 特异性引物设计与多重PCR的敏感性

4.2 多重PCR各引物之间的相互影响

4.3 临床样本检测探讨

5 结论

第三章 结核分枝杆菌复合群LAMP检测技术的建立及临床应用

引言

1 目的意义

2 材料方法

2.1 实验材料

2.3 实验方法

3 实验结果

3.1 LAMP中Mg~(2+)对扩增效率的影响

3.2 LAMP的最适温度

3.3 LAMP特异性的检测

3.4 LAMP敏感性的检测

3.5 SYBR GREENI检测LAMP扩增结果

3.6 酶切验证LAMP扩增的的正确性

3.7 阴性样本的验证性检测

3.8 临床样本检测结果

4 讨论

4.1 LAMP反应体系中各因子的影响

4.2 LAMP检测方法的敏感性和特异性

4.3 LAMP技术的应用前景

5 结论

参考文献

致谢