秦巴山区虎杖中产白藜芦醇(苷)内生真菌的分离鉴定

摘要

植物内生真菌(plant endophytic fungi)是指在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部、不引发宿主植物表现出明显感染症状的一类真菌。自Strobel.等于1993年首次从短叶紫杉(Taxus brevifolia)树皮中分离出一株内生真菌(Taxomycesandreanae)能产生紫杉醇(taxol)后，利用微生物发酵被认为是解决植化药物短缺的潜在途径。虎杖（Polygonurn cuspidatum）是秦巴山区一种广泛分布的中药材，其活性成分白藜芦醇（苷）具有抗癌、抑菌消炎、保肝利胆、抗氧化和降血脂等多方面的药理活性。本研究以虎杖为材料，分离得到了一些内生真菌，通过对菌株的分类鉴定和代谢产物的初步分析表明，部分内生真菌能发酵产生白藜芦醇苷（醇），具体研究结果如下。
　　 1虎杖内生真菌的分离、纯化及初步分类鉴定
　　 采用组织分离法，将新鲜虎杖根清洗干净，并对其表面进行消毒后，剪切成0.5mm×0.5mm的小块，接入PDA平板中，于28℃培养3～7d，分离、纯化得到116株内生真菌。形态分类结果初步表明，它们分别属于从梗孢目、壳霉目、黑盘孢目、毛霉目和无孢目5目，及曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、无孢类(Agonomycetaceae)、镰孢霉属（Fusarium）、毛霉属(Mucor)、拟盘多毛孢属(Pestalotia)、枝孢霉属（Cladosporium）、链隔孢属(Alternaria)及木霉属（Trichoderma）9属。
　　 2产白藜芦醇（苷)虎杖内生真菌的筛选
　　 将上述116菌株（还是部分代表菌株），分别接种于改良马铃薯液体培养基中，28℃，160r/min，培养7d后，按1:2(v/v或w/v)的比例，以乙酸乙酯分别对菌丝和发酵液萃取15min，合并萃取液，40℃真空旋转蒸发至干后，以甲醇溶解、定容至25mL，并以HPLC测定提取液中白藜芦醇（苷）的含量。获得两株可产白藜芦醇（苷）的内生真菌，分别为M-56和L-18。其中，M-56只产白藜芦醇苷，产量为1.029mg/L；L-18既产白藜芦醇苷又产白藜芦醇，含量分别为4.672和4.812mg/L。
　　 3产白藜芦醇（苷）虎杖内生真菌的鉴定
　　 根据菌落形态及显微形态的观察结果，将M-56和L-18菌株初步鉴定为链格孢属(Alternaria)和青霉属(Penicillium)真菌。在此基础上，对两菌株的ITS片段进行扩增，得到长度均为564bp的DNA片段。经测序并在NCBI数据库中进行ITS序列同源性比对，结果显示，M-56和L-18菌株的ITS序列分别和NCBI中收录的链格孢属及青霉属其它种的ITS序列同源性均为99％。结合形态学特征将M-56和L-18菌株鉴定为半知菌亚门丝孢目链格孢属(Alternaria)真菌和丛梗孢目丛梗孢科青霉属（Penicillium）真菌。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写表

第一章 文献综述

1 秦巴山区简介

2 虎杖及其研究现状

2.1 虎杖的生物学特征

2.2 虎杖的作用及其主要化学成分

2.3 白藜芦醇（苷）的研究现状

3 植物内生真菌与活性代谢产物

3.1 植物内生菌的定义

3.2 植物内生真菌的种类及分布

3.3 植物内生真菌的起源及其与宿主的关系

3.4 植物内生真菌代谢产抗肿瘤活性物质的研究

3.5 植物内生真菌的分离及分类鉴定

4 秦巴山区虎杖内生真菌的研究现状

5 本课题的研究目的及意义

第二章 虎杖内生真菌的分离、纯化及初步分类鉴定

1 材料

1.1 主要仪器

1.2 主要试剂

1.3 主要材料

1.4 培养基的配制

2 方法

2.1 玻璃器皿的清洗、灭菌及相关的实验准备

2.2 虎杖材料的处理

2.3 虎杖内生真菌的分离及纯化

2.4 虎杖内生真菌的初步分类鉴定

2.5 培养基灭菌及抗菌效果的检验

2.6 虎杖内生真菌及表面灭菌处理效果的检验

3 结果与分析

3.1 虎杖内生真菌的分离及纯化

3.2 虎杖内生真菌的初步分类鉴定

3.3 培养基灭菌、抑菌效果的检验

3.4 虎杖材料表面灭菌处理效果及其内生真菌的检验

4 讨论

第三章 代谢产白藜芦醇（苷）虎杖内生真菌的筛选研究

1 材料

1.1 主要仪器

1.2 主要试剂和材料

1.3 培养基

2 方法

2.1 液体发酵前的准备工作

2.2 虎杖内生真菌的液体发酵

2.2 发酵液及菌丝的处理

2.4 发酵液中白藜芦醇（苷）的HPLC分析检测

3 结果与分析

3.1 发酵液的抽提及菌丝的处理

3.2 白藜芦醇（苷）的萃取

3.3 白藜芦醇（苷）的分析检测

4 讨论

第四章 产白藜芦醇（苷）虎杖内生真菌的鉴定

1 材料

1.1 主要仪器

1.2 主要试剂和材料

1.3 培养基及主要溶液、试剂的配制

2 方法

2.1 内生真菌M-56和L-18的传统分类鉴定

2.2 内生真菌M-56和L-18的现代分子生物学分类鉴定

3 结果与分析

3.1 内生真菌M-56和L-18的形态学及菌丝显微结构特征

3.2 内生真菌M-56和L-18的现代分子生物学分类鉴定

4 讨论

第五章 总结与展望

1 总结

1.1 虎杖内生真菌的分离纯化及初步分类鉴定

1.2 主要试剂和材料

1.3 产白藜芦醇（苷）虎杖内生真菌的鉴定

2 展望

2.1 菌株驯化及发酵工艺条件优化

2.2 白藜芦醇（苷）的提取及分离纯化

参考文献

致谢