猪中受Myostatin调节的FS家族基因和TEF-1靶基因的克隆及功能研究

摘要

猪肉是我国人民动物蛋白主要来源，在畜禽肉产品消费中占有绝对优势，而猪肉的主要组成部分是骨骼肌，因此骨骼肌生长发育的遗传机制成为猪遗传改良工作者研究的重点之一。肌肉的生长速度是产肉动物主要生产性能之一，而肌纤维的数量和大小则主导着动物的产肉量，因此探究骨骼肌生长发育的分子调节机制是进行猪产肉性能改良的重要基础。在骨骼肌祖先细胞定向分化成肌管过程中，受到促进生长和抑制生长的细胞因子调节，并相互协调影响骨骼肌的生长发育过程。在促生长细胞因子调节下，激活骨骼肌特异转录调节基因家族[成肌增强因子(myocyte enhancer factor2, MEF-2)、生肌调节因子(myocyte regulatory factors，MRFs)]与转录增强因子1(transcriptional enhancer factor-1，TEF-1)等，在这些转录因子的共同作用下促进骨骼肌特异基因表达，进而促进骨骼肌生长；在抑制骨骼肌生成的调节因子肌肉生长抑素(Myostatin)的作用下，通过与活化素IIB型受体(Activin type II receptor B，ActR IIB)结合激活骨骼肌TGF-β(Transforming growth factor-β)信号通路，一方面上调细胞周期素依赖性蛋白激酶的抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor1A，Cdkn1a/p21)，抑制成肌细胞增殖和分化，从而抑制骨骼肌生长，另一方面通过上调卵泡抑素相似基因3(Follistatin-like3，Fstl3)表达，对Myostatin信号通路进行负反馈调节，抑制Myostatin的功能从而解除对骨骼肌生长的抑制作用。
　　本研究从骨骼肌生长发育过程中肌肉生长抑素（Myostatin）和促生长因子调节的骨骼肌转录增强因子TEF-1所调节的基因的鉴定与功能研究，拟从正负两个方向的调节因子所调节的基因的鉴定来研究骨骼肌生长发育过程中的重要基因，为猪的遗传改良提供功能基因。本研究所取得的主要研究结果如下：
　　1）受肌肉生长抑素Myostatin调节的FS家族基因的鉴定和功能研究。本研究通过同源比较方法和 RACE技术克隆猪 FSTL3、WFIKKN1(WAP, follistatin/kazal, immunoglobulin, kunitz and netrin domain containing1)、WFIKKN2 TV1(WFIKKN2 transcript variant1)和 WFIKKN2 TV2基因，它们的 mRNA序列分别为1806bp、1774bp、3142bp和3032bp，其中WFIKKN2 TV1和WFIKKN2 TV2为 WFIKKN2基因两个转录本；通过ORF Finder软件预测发现FSTL3、WFIKKN1、WFIKKN2 TV1和WFIKKN2 TV2四条mRNA分别编码262aa、529aa、580aa和483aa四种蛋白质， FSTL3、WFIKKN1和WFIKKN2 TV1是含有FS（Kazal type serine protease inhibitors and follistatin-like domain）结构域的分泌蛋白，WFIKKN2 TV2也含有FS结构域，但在蛋白 N-（氨基）端缺少分泌信号肽；利用辐射杂种板将猪 FSTL3、WFIKKN1和WFIKKN2基因分别定位在猪染色体SSC2q21，SSC3p1.2-1.3和SSC12p11；利用半定量RT-PCR进行组织表达谱分析，发现FSTL3和WFIKKN1基因在通城猪和大白猪五周龄心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉和脂肪组织中呈广泛表达， WFIKKN2 TV1、WFIKKN2 TV2和MSTN基因在心肌和骨骼肌中高表达；利用荧光定量RT-PCR研究发现MSTN和FSTL3基因在通城猪胚胎和出生后骨骼肌中表达模式相似，出生后表达量高于胚胎期，且MSTN在成年大白猪骨骼肌组织中高于通城猪；WFIKKN1、WFIKKN2 TV1和WFIKKN2 TV2三个基因表达模式在成年通城猪和大白猪骨骼肌中与MSTN相反即在成年通城猪骨骼肌中表达量高于成年大白猪；利用荧光定量RT-PCR发现骨骼肌中总卫星细胞比例和激活-增殖期卫星细胞比例在通城出生后1d，5w和成年骨骼肌中逐渐减少，且在大白不同发育时期骨骼肌中比例变化趋势与通城相似均随着骨骼肌发育不断降低，且高于通城；通过基因组SNP扫描发现在WFIKKN2基因编码区（WFIKKN2 TV1）第342位有一个G-A同义突变（c.342G>A）在通城试验群体中性状关联分析结果表明该基因与屠宰率和内脂率显著关联（p<0.05）。通过双荧光素酶报告系统对 WFIKKN2 TV1和WFIKKN2 TV2两个转录本启动活性检测，发现这两个启动子都受到Myostatin下调；通过超表达实验证明WFIKKN2 TV1编码蛋白有显著上调内源WFIKKN2表达功能，内源WFIKKN2上调表达水平随外源的转染量增加而逐渐上升，WFIKKN2 TV1转染的效应可以通过共转染外源MSTN得到回复，并促进C2C12细胞增殖。
　　2）转录增强因子TEF-1调节候选靶基因鉴定。根据芯片数据和生物信息学方法确定TEF-1候选基因，通过半定量和定量分析候选基因发现在TEF-1超表达C2C12细胞系中， Fzr1(Fzr1 fizzy/cell division cycle20 related1)基因和 Nudt6[nudix(nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif6]基因受超表达的TEF-1显著上调（p<0.05）；通过启动子双荧光报告系统检测结果表明 Fzr1基因正向和反向启动子都具有活性，且正向启动子活性受到超表达TEF-1显著上调，而反向启动子活性不受影响，Nudt6基因正向和反向启动均有活性，且在超表达TEF-1显著上调Nudt6正向和反向启动子活性。通过序列同源搜索方法和RACE技术分离克隆了猪NUDT6基因两个转录本(NUDT6 TV1和NUDT6 TV2）全长和FGF-2基因3’UTR(untranslated region)，它们序列长度分别为1071bp、1260bp和193bp；通过ORF Finder预测发现NUDT6 TV1不编码蛋白，NUDT6 TV2编码一个由313aa组成的有NUDIX保守结构域的分泌蛋白；利用辐射杂种板将猪 NUDT6基因定位在猪8号染色体SSC8q12-q23；利用半定量RT-PCR进行组织表达谱分析，发现NUDT6 TV1和NUDT6 TV2两个转录本在通城猪成年心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏，肌肉和脂肪组织中呈广泛表达；利用荧光定量RT-PCR研究发现, NUDT6和FGF-2基因在大白猪组织中表达比通城组织中高，且在两个品种各组织中表达变化趋势一致，这两个基因表达模式在检测的心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏和脂肪等组织呈负相关；通过对猪NUDT6基因SNP扫描发现在该基因编码区（NUDT6 TV2）695位有一个改变氨基酸的变异位点(c.695T>C)（氨基酸变异信息），在该基因3’UTR区域发现两个连续变异位点c.*43_44 TG>CA；通过ACRS-PCR-BclI-RFLP分析c.695T>C位点的基因型频率，结果表明在杜洛克，长白，玉山黑猪和通城猪四个品种中都是C等位基因占优势，且两个外来品种 C等位基型频率显著高于两个地方品种；利用PCR-NlaIII-RFLP方法对c.*43_44TG>CA位点进行基因型检测，结果表明在杜洛克和大白猪中 TG等位基因占优势，而荣昌猪、玉山黑猪和通城猪中都是 CA等位基因占优势；在通城试验群体中发现c.695T>C位点与内脂率，板油率和腿臀肉骨率存在显著关联（P<0.05），c.*43_44TG>CA位点与出生至上市日增重性状显著关联（P<0.05）；在大白试验群体中c.695T>C位点C等位基因与c.*43_44TG>CA位点TG基因型完全连锁，这两个位点性状关联结果表明与活体肌内脂肪性状和屠宰肌内脂肪性状显著关联（P<0.05）。

目录

声明

缩略词表

第一章 文献综述

1 问题由来

2 文献综述

3 研究目的和意义

第二章 受Myostatin调节的猪FS结构域家族基因的克隆与功能研究

1 前言

2 实验材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

第三章 TEF-1靶基因验证

1 前言

2 实验材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

第四章 TEF-1靶基因NUDT6在猪中的克隆、定位、表达模式及其与性状关联研究

1 前言

2 实验材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

结论

本研究的特色与主要创新点

本研究不足之处

参考文献

附录一 NUDT6基因转录本mRNA全长以及预测蛋白质序列

附录二 FSTL3基因DNA，mRNA全长以及预测蛋白质序列

附录三 WFIKKN1基因部分DNA，mRNA以及预测蛋白质序列

附录四 WFIKKN2基因DNA，mRNA以及预测蛋白质序列

附录五 不同物种FST和FSTL3氨基酸序列比对图和进化树

附录六 不同物种Myostatin和GDF-11氨基酸序列比对图和进化树

附录七 不同物种WFIKKN1和WFIKKN2氨基酸序列比对图和进化树

研究生期间论文发表情况

致谢