小鼠转录增强因子(TEF-1)下游靶基因的鉴定及猪SMYD家族三个基因的进化、表达与SNP筛查

摘要

基因的表达调控是当前分子生物学最前沿的研究领域之一，研究蛋白质与DNA相互作用，可以阐明基因的表达机制和发育的调控网络。我国猪肉产量和存栏数保持着逐年增长势头，如何从遗传上改良瘦肉生长是猪育种的重要研究内容。研究肌肉生长发育的调控机制将有助于从根本上解决这一问题，具有重要的理论和实践意义。
　　本研究是实验室前期研究工作的继续和深入。包括以下两个方面:①本课题组已针对TEF-1在猪上做了部分工作，发现TEF-1在成年通城猪的心脏中表达量最高，且在胚胎发育过程中TEF-1的表达量逐渐上升，表明该转录因子在猪肌肉发育中的潜在功能。由于目前无猪商业化抗体，本课题组邱海芳（邱海芳博士学位论文，2009）针对TEF-1转录因子在小鼠肌肉组织中做了ChIP-on-chip实验，钓取了小鼠TEF-1下游靶基因745个，并对这些基因进行生物信息学分类。但这些基因还未得到体外实验的证实。本研究借鉴和探索经典的转录因子研究方法：转录因子超表达、启动子活性分析、凝胶迁移率变动分析。试图筛选并证实几个受TEF-1调控的下游靶基因并揭示它们之间的调控通路。②选取了一类含有SET结构域的组蛋白赖氨酸转移酶家族SMYD，在本实验室彭勇波博士2008年所做的定位、荧光定量的研究基础上，深入研究它们在猪肌肉发育过程中的表达特征、进化特征、及SNP与肉质、生长性状之间的关联分析。目前取得的研究成果如下：
　　（1）通过生物信息学方法对芯片基因进行了分类和启动子预测。发现参与MAPK信号通路的三个基因，并用 TESS软件预测到这三个基因的启动子区有TEF-1结合位点。
　　（2）将本室已经构建好的TEF-1超表达载体转染细胞后，观察了靶基因表达量的变化情况。发现 FOS、MAP2KIP1基因的表达量比转染前略微升高而 RPS6KA2的表达量略微降低。
　　（3）构建了小鼠FOS、RPS6KA2基因启动子载体。将FOS、RPS6KA2的启动子区（包括 TEF1结合位点）插入到了 pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因（luciferase）前的多克隆位点处。
　　（4）将构建好的 FOS、RPS6KA2启动子载体和 TEF-1超表达载体共转染到BHK21，发现RPS6KA2的启动子活性在转染了TEF-1之后有了显著提高。
　　（5）对SMYD家族的SMYD1-3基因进行了不同物种间的同源比对、进化分析。进化树结果表明哺乳动物的这三个基因均首先聚为一类。接着是鸡和鱼。其次， SMYD1和SMYD2基因亲缘关系较SMYD3近些。
　　（6）利用RT-PCR的方法检测了SMYD1-3基因在成年大白组织中的表达情况，结果发现SMYD1基因在心脏和骨骼肌中表达量很高，而SMYD1和SMYD2基因在组织中广泛表达，且表达量都很高。
　　（7）在我室与通城县畜牧局合建的实验群体和黄陂群体中对SMYD1和SMYD2基因进行多态与性状关联分析，结果发现 SMYD1与内脂率存在显著相关的趋势；SMYD2与日增重存在显著相关的趋势。
　　本研究综合利用结合位点的分析，靶基因参与的信号通路以及基因的功能等多方面的信息筛选与肌肉生长发育相关的靶基因。且通过生物信息学预测，超表达，启动子活性分析等多种方法对靶基因进行验证，保证结果的准确性。尝试在实验室建立系统的转录因子研究方法。其次，继续深入的探讨SMYD家族基因在猪肌肉发育中的作用， SMYD1和SMYD2基因在肌肉组织中高表达和这两个基因物种间同源进化分析结果为该基因作为猪育种的候选基因提供了更为有力的证据。

目录

声明

缩略词表（ABBREVIATIONS）

1 前言

1.1 研究问题的由来

1.2 文献综述

1.3 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 芯片基因启动子的TEF-1结合位点预测

3.2 TEF-1超表达实验及结果

3.3 靶基因的启动子活性检测

3.4 启动子活性检测

4 讨论

4.1 关于启动子预测的讨论

4.2 关于研究TEF-1基因转录调控方法的讨论

4.3 TEF-1下游靶基因转录调控问题的讨论

5 小结

5.1 本研究的主要结果与结论

5.2 本研究的创新点与特色

5.3 本研究不足之处与进一步工作的建议

1 前言

1.1 研究问题的由来

1.2 文献综述

1.3 目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 猪SMYD1-3基因的cDNA序列分析

3.2 进化分析

3.3猪SMYD1-3基因表达模式分析

3.4 猪SMYD1-3基因的多态检测及关联分析

4 讨论

4.1 猪SMYD1-3基因的表达规律

4.2 猪SMYD1-3 基因的同源和进化分析

4.3 猪SMYD1-3基因与骨骼肌发育

5 小结

5.1 本研究获得的主要结果

5.2 本研究的创新点与特色

5.3 本研究的不足之处

参考文献

致谢